〔摘 要〕 目的 觀察血管性癡呆( VD) 大鼠在長(zhǎng)久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后行為學(xué)改變、 海馬 CA1 區(qū)病理變化及神經(jīng)元 5 -HT6 受體表達(dá)的變化。 方法 采用長(zhǎng)久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷模擬慢性腦缺血所致 VD， 在術(shù)后 4 w 和 8 w 進(jìn)行 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估假手術(shù)組和 VD 組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力， 對(duì)術(shù)后 2 d、1 w、4 w、8 w 的腦組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查( HE 染色、 Nissl 染色) 及**組織化學(xué)檢測(cè)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元 5 -HT6 受體的表達(dá)。 結(jié)果 術(shù)后 4、8 w VD 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均潛伏期是(87. 69 ± 7. 34) s、 (103. 77 ± 11. 18 ) s， 較同時(shí)間假手術(shù)組〔(48. 62 ± 7. 97 ) s、(36. 38 ± 17. 08) s〕 明顯延長(zhǎng)， 而空間探索試驗(yàn)中 VD 大鼠在目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間是 ( 16. 55 ± 3. 93 ) s、 ( 12. 66 ± 3. 30) s， 較假手術(shù)組〔( 27. 86 ±3. 16) s、(24. 37 ± 3. 75) s〕 明顯縮短。 VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元缺血性變性、 壞死隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重， 在術(shù)后 2 d、 1 w、 4 w、 8 w， VD 組海馬
CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元數(shù)目分別為 23 ± 2、17 ± 2、13 ± 2、5 ± 2， 而假手術(shù)組分別為 25 ± 2、26 ± 2、25 ± 2、27 ± 2。 **組化顯示海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元 5 -HT6 受體在雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后 1 w 表達(dá)開始減少， 術(shù)后 4 ～ 8 w 表達(dá)明顯減少。 結(jié)論 雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷所致的 VD 大鼠出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí) 、 記憶功能障礙， 海馬 CA1 區(qū) 5 -HT6 受體表達(dá)隨慢性腦缺血持續(xù)而下降， 該受體的表達(dá)下調(diào)可能與缺血性腦損傷所致的認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 血管性癡呆; 海馬; 5 -HT6 受體; 認(rèn)知障礙

腦血管病， 尤其是腦卒中后慢性腦缺血被認(rèn)為是血管性癡呆( VD) 的*常見病因 ， 其病理生理機(jī)制涉及缺血后繼發(fā)的腦能量代謝障礙、 炎癥因子的瀑布效應(yīng)、 氧化應(yīng)激損傷、 興奮性氨基酸毒性作用、 膽堿能神經(jīng)元功能缺失等〔 1〕 。 5 -羥色胺( 5 -HT)受體家族在**神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知、 情感、 攝食、 晝夜周期等生理活動(dòng)中具有調(diào)節(jié)作用〔 2〕 ， 其中 ， 5 -HT6 受體幾乎僅分布在中 樞神
經(jīng)系統(tǒng)， 尤其以紋狀體、 皮層、 邊緣系統(tǒng)等腦區(qū)的分布密度高，已被證實(shí)參與大腦學(xué)習(xí) 、 記憶、 情感等**智能和精神活動(dòng)〔 3〕 。本文采用大鼠長(zhǎng)久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷模型， 觀察腦缺血后海馬病理變化及 CA1 區(qū) 5 -HT6 表達(dá)的改變， 探討該受體與 VD 發(fā)病的相關(guān)性。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SPF 級(jí) Wistar 大鼠 80 只 ， 購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 體重 200 ～ 250 g， 雌雄比例為 1 ∶ 1 ， 所有實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于廣州**廣州總醫(yī)院動(dòng)物中心， 飼養(yǎng)房?jī)?nèi)溫度( 22 ± 3) ℃ ， 濕度 60% ， 5 只 /籠， 光 /暗周期為 12 h /12 h， 實(shí)驗(yàn)期間自由獲取水及標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。
1. 1. 2 主要試劑 兔抗鼠5-HT6 受體多克隆抗體購(gòu)自 Abcam 公司， Envision 二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Dako 公司， 二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 試劑購(gòu)自福州邁新生物公司， 其余化學(xué)試劑均為分析純級(jí) 。
1. 1. 3 主要儀器 Morris 大鼠水迷宮， SuperMaze 動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ， 日本 Olympus BX-51 顯微鏡， ImagePro plus 病理圖文分析系統(tǒng) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 動(dòng)物分組及模型制作 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 w 后隨機(jī)分成兩組， VD 組 50 只 ， 假手術(shù)組 ( SO 組) 30 只 。 動(dòng)物術(shù)前禁食 、 禁水 4 h， 稱重后以 10% 水合氯醛按 350 mg/kg 體重腹腔注射麻醉， 將大鼠仰臥位固定后常規(guī)**頸部手術(shù)區(qū)域， 在頸前正中作一長(zhǎng)約 1 cm 的縱形切口 ， 鈍性分離皮下軟組織 、 頸前肌群， 在氣管的側(cè)后方找到頸動(dòng)脈鞘， 分離頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)， 以 1 號(hào)絲線長(zhǎng)久性結(jié)扎頸總動(dòng)脈， 同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈， 局部**后恢復(fù)組織層次并縫合皮膚 。 SO 組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外， 其余操作與 VD 組大鼠一致 。 術(shù)后動(dòng)物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)， 自由獲取水源及飼料 。
1. 2. 2 動(dòng)物行為學(xué)觀察(Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)) 大鼠 Morris 水迷宮為一內(nèi)徑 160 cm、 高 50 cm 的圓形水池， 水池內(nèi)壁被漆成黑色， 池壁上黏貼不同形狀的空間標(biāo)記物， 一個(gè)直徑為 12 cm的逃生平臺(tái)固定于水池中的某一象限( 即目標(biāo)象限) ， 進(jìn)水后水面高出平臺(tái)約 1 cm， 水池上方橫架安裝連接計(jì)算機(jī)顯示系統(tǒng)的攝像儀。
SO 組和 VD 組大鼠分別在雙側(cè)頸總動(dòng) 脈阻斷術(shù)后 4、8 w進(jìn)行 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)， 第 1 ～ 4 天( 即 trial 1、trial 2、trial 3、trial 4) 將大鼠從四個(gè)不同象限面向水池壁放入水中 ， 大鼠找到逃生平臺(tái)后終止信息采集， *長(zhǎng)采集時(shí)間為 120 s， 若超過 120 s大鼠仍未能找到平臺(tái)， 則將其引導(dǎo)至逃生平臺(tái)并在平臺(tái)上站立20 s 以使其形成對(duì)空間參照物的記憶， 每只大鼠如此訓(xùn)練 4次 /d， 每次訓(xùn)練之間有 15 s 間歇以便休息， 連續(xù)訓(xùn)練 4 d， 記錄大鼠找到平臺(tái)的逃避潛伏期評(píng)估其空間學(xué)習(xí)能力 ; 第 5 天將逃生平臺(tái)從水池中 撤去， 將大鼠從四個(gè)不同象限投入水中 ， 記錄60 s 內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限搜尋的時(shí)間 ， 以此評(píng)估大鼠的空間記憶能力。 每天固定在 8: 00 ～ 17: 00 進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)， 實(shí)驗(yàn)過程中保持房間內(nèi)光照恒定并且無光線直射于水面， 水溫控制在 26℃左右， 迷宮外參照物保持不變。
1. 2. 3 組織標(biāo)本固定、 制片、 染色 每組各取 5 ～ 6 只大鼠分別在術(shù)后的相應(yīng)觀察終點(diǎn)麻醉動(dòng)物， 以 4℃ 預(yù)冷 4% 多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定， 斷頭取腦后從視交叉后 2 ～ 3 mm 處冠狀位切取厚度約 3 mm 的腦組織， 放入 10% 中性甲醛溶液中固定24 h。 在自動(dòng)脫水機(jī)中梯度酒精脫水、 透明、 浸蠟后包埋， 蠟塊組織作連續(xù)冠狀切片， 厚度 2 ～ 3 μm。 石蠟切片脫蠟、 水化后分別進(jìn)行蘇木素-伊紅 ( HE) 染色和 Nissl 染色， 在光學(xué)顯微鏡高倍鏡( × 400) 下觀察海馬 CA1 區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)。
1. 2. 4 **組化顯色分析海馬 CA1 區(qū) 5-HT6 受體的分布與表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、 水化， 置于 pH6. 0 的檸檬酸鹽中高壓修復(fù); 0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次， 3% 過氧化氫溶液避光孵育 10 min 以 阻 斷 內(nèi) 源 性 過 氧 化 物 酶， 0. 01 mol /L PBS 沖 洗5 min × 3 次， 切片滴加兔抗鼠 5-HT6 受體多克隆抗體(1 ∶ 1 000稀釋 ) ， 置 于 濕 盒 內(nèi) 4℃ 冰 箱 中 過 夜 孵 育; 次 晨 取 出 切 片0. 01 mol /L PBS 沖洗 5 min × 3 次， 滴加葡聚糖復(fù)合物( 二抗) ，室溫下孵育 40 min， 0. 01 mol /L PBS 沖洗 5 min × 3 次， 滴加DAB 顯色， 顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應(yīng)， 梯度酒精脫水、TO 生物透明劑透明 ， 中性樹膠封片后鏡檢觀察。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS13. 0 軟件進(jìn)行分析， 計(jì)量資料采用 x ± s 表示， 兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用 t 檢驗(yàn)， 多個(gè)樣本均數(shù)比較進(jìn)行 Levene 方差齊性檢驗(yàn)， 方差齊采用單向方差分析， 方差不齊采用 Brown-Forsythe 法; 平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足 Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗(yàn)時(shí)采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析，不滿足 Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗(yàn)經(jīng) Huynh-Feldt 系數(shù)校正自由度。
2 結(jié) 果
2. 1 大鼠 Morris 水迷宮結(jié)果 術(shù)后 4、8 w， SO 組和 VD 組大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均游泳速度均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) 。 術(shù)后 4 w 和 8 w， VD 組大鼠與同時(shí)間點(diǎn) SO 組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長(zhǎng)( P ＜0.001 ) ， 提示 VD 組大鼠在術(shù)后無明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙， 但存在空間學(xué)習(xí)能力減退， 而且學(xué)習(xí)能力下降隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)加重術(shù)后 4 w 空間探索試驗(yàn)中 ， SO 組和 VD 組大鼠目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＜ 0.001 ) ， 提示 VD 組大鼠空間記憶能力下降。
見表 1 ， 表 2， 圖 1。

2. 2 VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)組織病理學(xué)改變 HE 染色后在高倍鏡( × 400) 下， 假手術(shù)組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元排列整齊 、 緊密， 胞膜完整， 胞核清楚; 術(shù)后 2 d VD 組海馬 CA1 區(qū)未見明顯的病理變化， 錐體細(xì)胞數(shù)量略減少; 術(shù)后 1 w VD 組海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元排列基本正常， 但錐體神經(jīng)元數(shù)量減少; 術(shù)后 4 w VD 組CA1 區(qū)神經(jīng)元排列稀疏 、 紊亂， 錐體細(xì)胞變性壞死 、 數(shù)量明顯減少， 胞核固縮， 胞漿嗜酸性; 術(shù)后 8 w VaD 組海馬病理改變進(jìn)一步加重， 神經(jīng)元細(xì)胞空泡化， 錐體細(xì)胞基本消失 。 見圖 2。
尼氏染色后在高倍鏡 ( × 400) 下， 假手術(shù)組大鼠海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元胞質(zhì)中尼氏體豐富呈斑片狀; 術(shù)后 2 d VD 組大鼠海馬 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常， 神經(jīng)元尼氏體未見減少; 術(shù)后 1 w VD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元空泡化改變， 胞漿內(nèi)尼氏體減少; 術(shù)后 4 w， VaD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元固縮，細(xì)胞數(shù)明顯減少; 術(shù)后 8 w， VD 組海馬 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元排列稀疏、 紊亂， 胞漿中尼氏體顯著減少。 見圖 3， 圖 4。
2. 3 **組化分析海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元 5-HT6 受體表達(dá)變化與假手術(shù)組大鼠比較， VD 組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元 5-HT6 受體在術(shù)后 2 d 無明顯變化， 術(shù)后 1 w 表達(dá)略減少， 在術(shù)后 4 ～ 8 w亞組中表達(dá)明顯減少( P ＜ 0. 001 )。見圖 5， 表 3。

3 討 論
VD 是各種腦血管因素相關(guān)病因所致腦血流循環(huán)障礙并引起與認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元退行性改變 、 全腦功能退化的神經(jīng)退行性** 。 本文采用大鼠雙側(cè)頸總 動(dòng)脈阻斷模型模擬人類因慢性腦缺血 、 全腦低灌注所致的 VD， 該模型引起典型的皮層缺血性改變和皮層下白質(zhì)病變， 包括白質(zhì)疏松化 、 脫髓鞘 、 膠質(zhì)增
生等， 與人類老齡化或腦卒中后癡呆的神經(jīng)病理改變相似， 是VD 的經(jīng)典動(dòng)物模型〔 4 〕 。 Farkas 等〔 5〕 指出大鼠長(zhǎng)久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷模型術(shù)后腦血流的減少是有選擇性的， 以皮層和白質(zhì)腦血流下降*為明顯， 僅為正常大鼠的 35% ～ 45% ， 海馬腦血流下降到正常大鼠的 60% 左右， 術(shù)后 1 w 腦血流開始恢復(fù)， 但4 w以后腦血流仍明顯低于正常對(duì)照的動(dòng)物， 術(shù)后 8 ～ 12 w 腦血流基本恢復(fù)到正常水平。 本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)缺血急性期海馬損傷并不十分明顯， 術(shù)后 1 ～ 2 w 可以在海馬觀察到 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元丟失、 膠質(zhì)細(xì)胞激活， 并且這種缺血性損害隨著腦缺血狀態(tài)的持續(xù)而進(jìn)行性加重， 術(shù)后 4 w 海馬 CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元明顯減少， 神經(jīng)元空泡樣變性， 術(shù)后 8 w 海馬病變呈毀滅性， 錐體細(xì)胞顯著減少， 這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致〔 6〕 。 雖然慢性缺血過程中腦血流通過側(cè)支循環(huán)重建等各種代償機(jī)制使全腦血流在8 ～ 12 w 后逐漸恢復(fù)到正常水平， 但低灌注對(duì)海馬造成的缺血性損害是不可逆的。 實(shí)驗(yàn)中術(shù)后 8 w VD 組大鼠在定位航行試驗(yàn)中逃避潛伏期較假手術(shù)對(duì)照組明顯延長(zhǎng)， 空間探索試驗(yàn)中在目標(biāo)象限的搜尋時(shí)間亦較假手術(shù)組減少， 均提示海馬缺血性損傷對(duì) VD 大鼠造成的空間學(xué)習(xí) 、 記憶能力減退的影響。 一方面，海馬作為腦內(nèi) 參與學(xué)習(xí) 、 記憶等**智能活動(dòng)的重要腦區(qū)， 因其特殊的供血結(jié)構(gòu)而對(duì)缺血極為敏感， 另一方面， 錐體神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)( LTP) 是記憶形成的重要神經(jīng)生理基礎(chǔ)， 推測(cè)海馬慢性缺血性損傷、 錐體神經(jīng)元丟失參與了 VD 的發(fā)病機(jī)制。
目前， 已發(fā)現(xiàn) 5-HT 受體家族包括七種分型 (5-HT1 ～ 7 R) ，5-HT1 A、5-HT4 和 5-HT6 受體是在多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中被發(fā)現(xiàn)與**神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知、 學(xué)習(xí)、 記憶等思維活動(dòng)密切相關(guān)的受體亞型〔 7〕 ， 其中 ， 5-HT6 受體幾乎僅分布于**神經(jīng)系統(tǒng)， 而且其所分布的腦區(qū)均與人類的認(rèn)知、 學(xué)習(xí)、 記憶、 情感等功能相關(guān)，在腦內(nèi)與乙酰膽堿、 谷氨酸、 γ-氨基丁酸、 腎上腺素、 去甲腎上腺素等多種參與學(xué)習(xí) 、 記憶、 情感、 認(rèn)知過程的神經(jīng)遞質(zhì)均有相互作用〔 3〕 。 在與學(xué)習(xí)、 記憶密切相關(guān)的海馬， 5-HT6 受體主要分布在 CA1 區(qū)神經(jīng)元突觸后膜上。 基于雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷后腦血流的動(dòng)態(tài)改變及海馬缺血性損傷的時(shí)間特點(diǎn)， 實(shí)驗(yàn)中選擇了術(shù)后 2 d、1 w、 4 w、 8 w 作為 5-HT6 受體表達(dá)水平的觀察時(shí)間點(diǎn)。行為學(xué)觀察結(jié)果證實(shí) VD 大鼠存在明顯空間學(xué)習(xí) 、 記憶能力缺失， 且這種學(xué)習(xí) 、 記憶能力的減退隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)加重。 結(jié)合**組化結(jié)果分析， VD 大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元上 5-HT6 受體的表達(dá)在腦缺血術(shù)后 1 w 開始下降， 以術(shù)后 4 ～ 8 w 受體表達(dá)下調(diào)*為顯著， 5-HT6 受體表達(dá)的下調(diào)與動(dòng)物學(xué)習(xí) 、 記憶功能下降的時(shí)間基本一致。 基于 Morris 水迷宮是海馬依賴性的行為學(xué)檢測(cè)方法， 因此推測(cè) VD 大鼠空間學(xué)習(xí) 、 記憶能力減退與神經(jīng)元 5-HT6 受體表達(dá)改變相關(guān)。 一方面， 考慮到慢性缺血對(duì)海馬所造成的組織病理學(xué)改變， 尤其是錐體神經(jīng)元的變性壞死、 丟失， 可能導(dǎo)致受體蛋白表達(dá)、 合成減少; 另一方面， 國(guó)外研究證實(shí)拮抗 5-HT6 受體可以促進(jìn)腦內(nèi)乙酰膽堿釋放〔 8， 9〕 ， 后者是記憶形成與維持的重要神經(jīng)遞質(zhì) ， 而且動(dòng)物行為學(xué)研究 發(fā)現(xiàn) 5-HT6 受體拮抗劑能提高學(xué)習(xí) 、 記憶、 改善認(rèn)知功能 〔 10〕 并可以逆轉(zhuǎn)由抗膽堿能**( 如東莨菪堿) 所致的記憶缺損， 因此， 可以推測(cè)慢性腦缺血后期 5-HT6 受體表達(dá)下調(diào)可能是**神經(jīng)對(duì)抗缺血性損傷的一種保護(hù)機(jī)制， 通過受體表達(dá)下調(diào)重新調(diào)節(jié)神經(jīng)信息網(wǎng)絡(luò)中其他神經(jīng)遞質(zhì) ， 如乙酰膽堿、 谷氨酸等的水平， 從而提高**神經(jīng)對(duì)缺血性腦損傷后認(rèn)知功能障礙的耐受性。
綜上所述， 海馬是高等動(dòng)物學(xué)習(xí) 、 記憶過程中重要的信息整合**， 5-HT6 受體表達(dá)于海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元， 拮抗該受體可以提高海馬中乙酰膽堿的水平， 在發(fā)生慢性腦缺血后上述區(qū)域該受體表達(dá)隨缺血進(jìn)展而減少可能是**神經(jīng)信息網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的一種代償機(jī)制。