摘要: 目的: 探討胞二磷膽堿對(duì)***麻醉致幼期大鼠長期認(rèn)知功能損害的**作用。方法: 54 只雄性PND7 大鼠幼鼠根據(jù)出生時(shí)間和處理方式分成 9 組: ①14 d 對(duì)照組( C14d組) 、14 d ***組( K14d組) 、14 d 異氟烷 + 胞二磷膽堿組( K + C14d組) ; ②30 d 對(duì)照組( C30d組) 、30 d ***組( K30d組) 、30 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C30d組) ; ③60 d 對(duì)照組( C60d組) 、60 d ***組( K60d組) 、60 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C60d組) 。K14d組、K30d組、K60d組、K + C14d組、K + C30d組和 K + C60d組均在生后第 7 天、第9 天、第11 天、第13 天腹腔注射*** 70mg/kg，C14d組、C30d組和 C60d組在出生 7 d 后，腹腔注射生理鹽水( 0． 5 ml，1 次/d，連續(xù) 7d) 。K + C14d組、K + C30d組、K + C60d組大鼠在腹腔注射***后當(dāng)天腹腔注射胞二磷膽堿500 mg/kg( 0． 5ml，1 次 / d，連續(xù) 7 d) 。大鼠分別在出生后 14d、30 d 和 60 d 進(jìn)行條件恐懼實(shí)驗(yàn)測試認(rèn)知功能。結(jié)果: 條件恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 條件關(guān)聯(lián)和條件暗示測試中，在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組兩組間的恐懼凝滯時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0．05) ，但均短于 C14 d 組大鼠( P ＜0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d組短于 C30d組和 K+ C30d( P ＜0． 05) ，C30d組與 K + C30d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和K + C60d( P ＜0． 05) ，C60d組與 K + C60d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) 。結(jié)論: 多次***( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉可引起幼期大鼠長期的學(xué)習(xí)記憶能力損害; 胞二磷膽堿腹腔注射可抑制***麻醉對(duì)幼期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

關(guān)鍵詞: ***; 學(xué)習(xí)記憶; 胞二磷膽堿; 認(rèn)知功能障礙

***是臨床上( 尤其嬰幼兒麻醉) 常用的全身***。雖然***在大腦缺血等腦損害中有明顯的抗損傷保護(hù)作用，但*近研究提示***麻醉可以誘導(dǎo)處于腦發(fā)育期的大鼠腦神經(jīng)元凋亡以及成年期后學(xué)習(xí)記憶改變。這提示幼期( 出生后早期或胎兒期) 經(jīng)歷麻醉對(duì)大腦學(xué)習(xí)能力的發(fā)育是一個(gè)危險(xiǎn)因素。目前，對(duì)麻醉誘致的認(rèn)知功能損害尚無有效的防治辦法。胞二磷膽堿是細(xì)胞膜磷脂生物合成所需的中間物，基本結(jié)構(gòu)包含胞苷和膽堿兩部分。有研究提示，胞二磷膽堿可通過多途徑抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)受損害的神經(jīng)元修復(fù)。但胞二磷膽堿應(yīng)用于**麻醉所致的神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能損害少有報(bào)道。本研究擬通過應(yīng)用***麻醉出生后 7 d( postnatal days 7，PND7) 的大鼠幼鼠，觀察***麻醉對(duì)大鼠幼鼠認(rèn)知功能的影響及腹腔注射胞二磷膽堿對(duì)***麻醉所致的認(rèn)知功能損害的**作用。

1 材料和方法

1． 1 動(dòng)物和分組 54 只雄性 PND7 大鼠幼鼠分組( 共 9 組，每組 6 只) : ①14 d 對(duì)照組( C14d組) 、14 d ***組( K14d組) 、14 d *** + 胞二磷膽堿組( K +C14d組) 。若同窩內(nèi)雄性幼鼠 ＜ 3 只，該窩大鼠不納入實(shí)驗(yàn); 若同窩內(nèi)雄性幼鼠≥3 只，1 只分至 C14d組、1 只分至 K14d組、1 只分至 K + C14d組; 若同窩內(nèi)雄性幼鼠≥6 只，2 只分至 C14d組、2 只分至 K14d組、2 只分至 K +C14d組，以此類推分組。②30 d 對(duì)照組( C30d組) 、30 d***組( K30d組) 、30 d *** + 胞二磷膽堿組( K +C30d組) ; ③60 d 對(duì)照組( C60d組) 、60 d ***組( K60d組) 、60 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C60d組) 。②、③分組辦法同①。

1． 2 麻醉處理和**注射 C14d組、C30d組和 C60d組，K14d組、K30d組、K60d組、K + C14d組、K + C30d組和 K + C60d組均在生后第 7 天、第 9 天、第 11 天、第 13 天腹腔注射*** 70 mg/kg( 0． 5 ml) 。K + C14d組、K + C30d組、K + C60d組大鼠在腹腔注射***后當(dāng)天腹腔注射胞二磷膽堿 500 mg/kg( 0． 5 ml，1 次/d，連續(xù) 7 d) ，其余所有大鼠均腹腔注射生理鹽水 0． 5 ml( 1 次/d，連續(xù) 7d) 。麻醉期間將大鼠置于棉墊上，棉墊底部墊有電加熱毯，調(diào)節(jié)并控制受試動(dòng)物體溫為38 ～39 ℃。麻醉復(fù)蘇后剪耳標(biāo)記并放回母籠飼養(yǎng)，分別在出生后14 d、30d 和 60 d 進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶能力測試。在飼養(yǎng)過程中若同窩配對(duì) 3 只中任一大鼠死亡，配對(duì)中另 2 只亦剔出該實(shí)驗(yàn)，另擇符合條件動(dòng)物加入補(bǔ)充。

1． 3 條件恐懼實(shí)驗(yàn) 采用條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)( XＲ-XC404 型，上海欣軟信息科技有限公司) 進(jìn)行測試。測試分兩天進(jìn)行: 第 1 天，在 3 min 的適應(yīng)探索期后給予 3 次聲音( 2 000 Hz，90 dB，30 s) + 電流刺激( 1mA，2 s; 電流刺激在聲音的*后 2 s 開始，與聲音同時(shí)結(jié)束) ，3 次聲音間隔為 1 min; 第 2 天進(jìn)行條件關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)( contextual fear conditioning，context) 和條件暗示實(shí)驗(yàn)( cued fear conditioning，cue) 。在 context 實(shí)驗(yàn)中，大鼠置于一個(gè)與第 1 天實(shí)驗(yàn)相同的場景中，無聲音和電流刺激，錄像 8 min; 在 cue 實(shí)驗(yàn)中，大鼠置于一個(gè)與第1 天實(shí)驗(yàn)不同環(huán)境的方盒中，在 3 min 的適應(yīng)探索期后給予 3 次聲音( 2 000 Hz，90 dB，30 s，無電流刺激) ，3次聲音間隔為 1 min，錄像 8 min。圖像分析軟件自動(dòng)計(jì)算統(tǒng)計(jì) context 和 cue 實(shí)驗(yàn)中大鼠的凝滯時(shí)間及所占時(shí)間百分比。

1． 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 15． 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，定量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x－± s) 表示。采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2． 1 條件關(guān)聯(lián)測試結(jié)果 在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組恐懼凝滯時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d組大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第30 天，K30d組短于 C30d組和 K + C30d組( P ＜0． 05) ，K30d組與 K + C30d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和 K + C60d組 ( P ＜0． 05) ，K60d組與 K + C60d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) 。見表 1。

2． 2 條件暗示測試結(jié)果 在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組兩組間的恐懼凝滯時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d組大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d組短于 C30d組和 K + C30d組( P ＜0． 05) ，K30d組與 K + C30d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和 K + C60d組( P ＜0． 05) ，K60d組與 K + C60d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0． 05) 。

3 討論

條件恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)又名場景恐懼系統(tǒng)，是檢測嚙齒類動(dòng)物對(duì)環(huán)境相關(guān)條件性恐懼的學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)，是評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力常用方法之一。大鼠在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的行為凝滯狀態(tài)( Freezing，動(dòng)物特有的、靜止不動(dòng)的防御姿勢) 。條件恐懼實(shí)驗(yàn)分環(huán)境聯(lián)系( 條件關(guān)聯(lián)，context) 實(shí)驗(yàn)和聲音信號(hào)實(shí)驗(yàn)( 條件暗示，cue) 兩部分。Context 實(shí)驗(yàn)中的凝滯時(shí)間反映大鼠海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力，cue 實(shí)驗(yàn)中的凝滯時(shí)間反映大鼠非海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力。測試中凝滯時(shí)間 延 長 為 促 進(jìn) 記 憶，凝 滯 時(shí) 間 縮 短 為 記 憶損害。

大鼠大腦發(fā)育的高峰期主要是出生后 2 周內(nèi)( 相當(dāng)于人類的 3 歲以內(nèi)) ，此高峰期也是神經(jīng)元突觸形成建立的關(guān)鍵期。因此在此關(guān)鍵期內(nèi)，大腦的發(fā)育狀況將直接影響成年期后的大腦功能的**功能。有研究表明，***麻醉可能對(duì) PND 大鼠海馬神經(jīng)元有促進(jìn)凋亡的作用，并影響其學(xué)習(xí)記憶能力，這種影響還可能與麻醉時(shí)間有關(guān)。因此，本研究選擇處于大腦發(fā)育期的 PND7 大鼠作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行***腹腔注射麻醉。有研究表明，低于 50 mg/kg 劑量、重復(fù)少于 3 次的腹腔***注射麻醉對(duì)幼鼠長期學(xué)習(xí)記憶能力無明顯損害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 70 mg/kg ***麻醉對(duì)海馬依賴和非海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力均有明顯損害作用; 而且***麻醉對(duì) PND7 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害比較持久( 可致出生后 60 d 或更久) 。

突觸是神經(jīng)元信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，**神經(jīng)元以突觸的形式形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力的發(fā)育極為重要。學(xué)習(xí)記憶功能與海馬神經(jīng)元的數(shù)量之間存在著依賴關(guān)系。有研究表明，***麻醉能夠影響新生大鼠的突觸發(fā)育，并且影響其學(xué)習(xí)記憶功能。

胞二磷膽堿是常用的**神經(jīng)保護(hù)劑。有研究表明，胞二磷膽堿對(duì)大鼠腦缺血損傷后的認(rèn)知功能損害有明顯的**作用。本研究結(jié)果顯示，腹腔***注射麻醉 PND7 大鼠期間連續(xù) 7 d 應(yīng)用 500 mg/kg胞二磷膽堿腹腔注射，至出生后 30 d 可使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)至正常水平，提示胞二磷膽堿可以明顯抑制***麻醉對(duì) PND7 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害作用。

綜上所述，多次***( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉對(duì)幼期大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損害能持續(xù)至成年( 出生后 60 d 或更久) ; 胞二磷膽堿腹腔注射可抑制***麻醉對(duì)幼期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。