摘要目的: 觀察針刺對抑郁大鼠的行為學(xué)改變及作用機(jī)制。方法: 將18 只雄性WKY 大鼠隨機(jī)分為電針組( EA) 、假針組( sham EA) 、模型組( model) 。Wistar 雄性大鼠6 只設(shè)為正常組( normal) 。21 d 后通過糖水使用、強(qiáng)迫游泳實驗對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評價，用**熒光法檢測大鼠海馬中β-CaMKⅡ表達(dá)。結(jié)果: 與正常組比較，模型組海馬β-CaMKⅡ表達(dá)和蔗糖水?dāng)z入比均明顯下降( P ＜ 0. 05) ，強(qiáng)迫游泳的不動時間增加( P ＜ 0. 05) 。與假針組比較，電針組海馬β-CaMKⅡ表達(dá)和蔗糖水?dāng)z入比均明顯增加( P ＜ 0. 05) ，強(qiáng)迫游泳的不動時間減少( P ＜ 0. 05) 。結(jié)論: 電針對WKY 抑郁模型大鼠的行為學(xué)核心癥狀有明顯的改善作用，明顯增加海馬中β-CaMKⅡ的表達(dá)，這可能是電針通過影響海馬的β-CaMKⅡ從而**抑郁癥的機(jī)制之一。
關(guān)鍵詞電針; 抑郁癥; 韁核; β-CaMKⅡ
抑郁癥是一種以悲傷、內(nèi)疚、興趣減弱、快感缺失等多種軀體心理癥狀為表現(xiàn)的嚴(yán)重精神障礙性**，嚴(yán)重者有**傾向。研究顯示，抑郁癥的發(fā)病在世界范圍內(nèi)逐年上升，帶來的巨大的經(jīng)濟(jì)和精神心理負(fù)擔(dān)給家庭和社會造成了巨大的影響。抑郁癥病因復(fù)雜而多樣，可能與基因、心理及周圍環(huán)境等多種因素共同作用而相關(guān)［3］。經(jīng)典的抗抑郁**使用普遍，但仍具有作用效果延遲、**使用依賴、**效果不確定性等缺點。傳統(tǒng)病理生理學(xué)分子機(jī)制認(rèn)為抑郁癥主要與大腦內(nèi)的單胺能神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的水平失衡相關(guān)，近年來另外一種神經(jīng)可塑性假說受到了越來越多的認(rèn)可。該假說認(rèn)為韁核中β-CaMKⅡ在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵的作用，長期的負(fù)面情緒對包括韁核、海馬在內(nèi)的與獎賞情緒相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路造成可塑性的變化，從而加重抑郁癥狀。針灸在調(diào)治精神疾患的使用已具有上千年的歷史，且療效顯著易于推廣。電針**后對海馬β-CaMKⅡ的研究尚少，我們在本實驗旨在觀察電針后海性的改變，從而探討電針**抑郁癥的相關(guān)機(jī)制。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 動物4 周齡Wistar 和Wistar Kyoto( WKY)SPF 級雄性大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證編號: SCXK( 京) 2012-0001。動物購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由攝食飲水，12 h 晝夜循環(huán)，室溫( 22 ± 2) ℃，相對濕度為50% ～ 60%。
1. 1. 2 試劑與儀器蔗糖，購于Sigma 公司。5%蔗糖水溶液: 蔗糖100 g 溶于蒸餾水中，定容至2L;異氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司; 4% 多聚甲醛，上海元象醫(yī)療器械有限公司; 一抗，novus 公司NB600-1428，1: 50; 熒光二抗，488-山羊抗小鼠，谷歌生物GB25301; 二甲苯，國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司; DAPI，谷歌生物，G1012; 抗熒光淬滅封片劑，谷歌生物，G1401; G6805 _1A 電針**儀購于上海華誼醫(yī)用儀器廠; 強(qiáng)迫游泳實驗系統(tǒng)購于上海欣軟信息科技有限公司; 包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司，JB-P5; 倒置熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)，日本尼康，NikonEclipse Ti-SＲ/Nikon DS-U3。
1. 2 方法
1. 2. 1 分組與操作18 只WKY 大鼠隨機(jī)分至電針組、假針組和模型組; Wistar 大鼠6 只設(shè)為正常組。并記錄初始體重。正常組、模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不予**。
電針組: WKY 大鼠8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。根據(jù)《實驗動物針灸穴位圖譜》選取大鼠“百會”“印堂”穴為**穴位。將電針**儀導(dǎo)線的正負(fù)極兩端露出銅絲并纏繞于0. 25 mm × 25 mm—次性不銹鋼毫針上，膠布固定。在透明儲物盒底部鉆3 個直徑約為1 cm 的小孔，與導(dǎo)線相連的毫針通過其中一個孔，另外2 個小孔為通氣孔。**時，將大鼠置于實驗臺上，分別刺入百會，印堂穴約5 mm，膠布固定針灸針。將事先準(zhǔn)備好的透明儲物盒蓋住大鼠后，采用電針儀，頻率設(shè)置為2Hz 連續(xù)波電，電流強(qiáng)度根據(jù)大鼠的耐受情況調(diào)整，即頭部出現(xiàn)顫動并且不嘶
叫為度，從0. 1 mA 開始依次逐漸加大，每次**15min，共3 周。**過程中，注意觀察大鼠是否要將針灸針剝掉，如有上述情況，可輕輕拍打儲物盒，轉(zhuǎn)移大鼠注意力。另外，保持整個實驗環(huán)境的安靜，避免聲音或動作過大造成大鼠恐慌。
假針組: WKY 大鼠6 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。采用與電針組同樣的抓取方法，將同型號針灸針刺入大鼠百會、印堂體表，針灸針與導(dǎo)線相連，不通電。留針時間與**時間均同電針組。
1. 2. 2 檢測指標(biāo)與方法
1. 2. 2. 1 糖水偏好實驗( Sucrose Preference Test，SPT) 正式實驗前48 h，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水。**個24 h，每籠均放置2 個水瓶，其中1 瓶為5%蔗糖水150 mL，另一瓶為純水150 mL。隨后24 h，禁食禁水。正式實驗時，給予大鼠5% 蔗糖水和純水各150 mL，12 h 后兩瓶水的位置進(jìn)行調(diào)換，24 h后根據(jù)每只大鼠的糖水和純水的飲用量來分別得出糖水喜好比。計算公式為: ［( 糖水飲用量) /( 糖水飲用量) + ( 純水飲用量) ］× 100%［8］。
1. 2. 2. 2 強(qiáng)迫游泳實驗( Force Swimming Test，F(xiàn)ST)
強(qiáng)迫游泳實驗裝置為高40 cm，直徑30 cm 的透明丙稀酰胺樹脂材料圓桶。將大鼠置于水溫為23～ 25 ℃，水位32 cm 的圓桶中，保證大鼠后肢不能觸及圓桶底部。實驗**天對全部大鼠進(jìn)行15 min預(yù)游，結(jié)束后擦干繼續(xù)飼養(yǎng)。24 h 后進(jìn)行5 min 的強(qiáng)迫游泳測試，記錄并分析不動時間( 漂于水面，不動或微小動作時間) 。每只大鼠測試結(jié)束后需重新?lián)Q干凈的水，避免**糞便及氣味對下一只大鼠測試造成干擾。
1. 2. 2. 3 **熒光( Immunofluorescence) 行為學(xué)試驗后麻醉、開胸，經(jīng)左心室冷藏生理鹽水沖洗至兩肺變白后，4%多聚甲醛灌流固定，取腦后石蠟包埋，修整切片( 6um) 。之后操作如下:1) 石蠟切片脫蠟至水: 二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-5%乙醇5 min-蒸餾水洗。2) 抗原修復(fù):置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液( pH6. 0) 中修復(fù)。中火8 min，?；? min，轉(zhuǎn)中低火7 min。冷卻后置于PBS( pH7. 4) 中晃動洗滌5 min × 3 次。3) BSA 封閉: 滴加3%BSA 室溫封閉30 min。4) 加一抗?jié)窈袃?nèi)4 ℃孵育過夜。5) 加二抗，晃動洗滌5 min × 3 次。滴加二抗避光室溫孵育50 min。6) DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，晃
動洗滌5 min × 3 次。滴加DAPI 染液避光室溫孵育10 min。7) 封片: 晃動洗滌5 min × 3 次用抗熒光淬滅封片劑封片。8) 鏡檢拍照: 切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。( 紫外激發(fā)波長330 ～380 nm，發(fā)射波長420 nm; FITC 紅光激發(fā)波長465 ～495 nm，發(fā)射波長515 ～ 555 nm) 。DAPI 染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，β-CaMKⅡ陽性表達(dá)為
相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光。在顯微鏡下記錄陽性表達(dá)個數(shù)，每只大鼠選取5 張切片，每個切片選取3 個視野，取其平均數(shù)。
1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差( 珋x ±s) 表示，用SPSS 21. 0 統(tǒng)計軟件分析處理。多組間比較采用單因素方差分析( One-Way ANOVA) ，多組間兩兩比較用LSD 法。所有統(tǒng)計結(jié)果均以P ＜ 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 電針對各組大鼠蔗糖水喜好比的影響電針組與假針組比較，喜好率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ，但低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜ 0. 05) ; 模型組、假針組與正常組比較喜好率明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0. 01) 。表示W(wǎng)KY 鼠蔗糖水喜好率低于正常大鼠，可代表為興趣缺失的表現(xiàn)，電針可改善抑郁模型大鼠興趣缺失的癥狀。
見表1。
2. 2 電針對各組大鼠強(qiáng)迫游泳實驗的影響電針組與假針組比較，強(qiáng)迫游泳的不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ，模型組與正常組比較不動時間顯著增大，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0. 01) 。WKY 大鼠在強(qiáng)迫游泳中的不動時間越長，表明求生欲望越低，其抑郁癥狀越明顯，該數(shù)據(jù)表明與正常組比較，WKY 大鼠抑郁癥狀明顯，經(jīng)電針**后，可減少WKY 大鼠強(qiáng)迫游泳中不動時間，改善抑郁癥狀。見表2。
2. 3 電針對β-CaMKⅡ**熒光技術(shù)的檢測**熒光檢測結(jié)果顯示，圖中箭頭所指色的圓圈樣表達(dá)為β-CaMKⅡ的陽性表達(dá)，藍(lán)色為細(xì)胞核的顯像，由上至下分別為電針組、假針組、模型組和正常組; 由左至右分別為單β-CaMKⅡ的陽性表達(dá)、單細(xì)胞核表達(dá)和β-CaMKⅡ與細(xì)胞核融圖。電針組與假針組比較，海馬中β-CaMKⅡ陽性表達(dá)個數(shù)明顯增加( P＜ 0. 05) ，模型組與正常組比較β-CaMKⅡ陽性表達(dá)數(shù)減少( P ＜ 0. 01) 。β-CaMKⅡ在WKY 大鼠海馬中表達(dá)越高，說明海馬的突觸可塑性傳遞活性越強(qiáng)，其抑郁癥狀越輕，該數(shù)據(jù)表明與正常組比較，WKY 大
鼠海馬活性較低，經(jīng)電針**后，可增加海馬核中β-CaMKⅡ的表達(dá)，改變海馬活性，改善抑郁癥狀。
3 討論
抑郁癥在中醫(yī)屬于“郁病”“癲病”“百合病”等病癥范疇。中醫(yī)認(rèn)為情志是抑郁癥的重要致病原因，但是否發(fā)病與情志刺激的強(qiáng)度、持續(xù)時間和體質(zhì)狀況有密切聯(lián)系。此病位在腦，與心、肝、腎等多個臟腑有關(guān)。“病變在腦，首取督脈［9］”，**應(yīng)以督脈的穴位為主來醒腦開竅、化郁開結(jié)、暢達(dá)情志。督脈與腦的關(guān)系密不可分，在**抑郁癥中起著重要的作用。百會為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)之會，位于頭頂之顛，有醒腦開竅，升提陽氣之功，是寧心**、定驚益智的要穴?！夺樉拇蟪伞?span style="font-family:AdobeHeitiStd-Regular;">云
”印堂為經(jīng)外奇穴，是督脈在前額所過之處，為調(diào)神清腦、疏通腦絡(luò)的要穴，兩穴相配伍可增強(qiáng)**情志疾患的療效，而且可以減少多個穴位在**中產(chǎn)生的不確定性。本課題組長期應(yīng)用此二穴于抑郁癥的**，不僅起效快、無**反應(yīng)，還可以有效改善飲食、消化、運(yùn)動等多系統(tǒng)伴發(fā)紊亂的癥狀［10］。WKY 抑郁模型大鼠模擬了抑郁癥患者的核心臨床癥狀，被廣泛應(yīng)用于機(jī)制和療效研究［11］。本實驗中WKY 大鼠明顯處于抑郁狀態(tài)，與正常大鼠SPT和FST 中活動性的測試均可體現(xiàn)出興趣降低、快感缺失等特點，證明該模型符合抑郁模型成功的評判標(biāo)準(zhǔn)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，電針可明顯的改善抑郁大鼠行為學(xué)癥狀，可以增加大鼠對蔗糖水的攝入量，減
少大鼠在強(qiáng)迫游泳中的不動時間，多方面改善大鼠的抑郁行為學(xué)表現(xiàn)。而這種電針對行為學(xué)的作用，可能是通過調(diào)節(jié)海馬的β-CaMKⅡ而實現(xiàn)的。
關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，傳統(tǒng)經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說認(rèn)為是由于腦內(nèi)去單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂而造成的，然而此學(xué)說并不能完全解釋抑郁癥的機(jī)制，且在其指導(dǎo)下的用藥也有局限性。Li［6］等發(fā)現(xiàn)韁核中β-CaMKⅡ的過度表達(dá)可增加突出傳遞效率和抑郁樣核心癥狀，通過干預(yù)下調(diào)其表達(dá)后，則動物的抑郁癥狀發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。在臨床的突破性**中也證實了韁核在其中的作用［12］。他在**神經(jīng)系統(tǒng)的單胺類神經(jīng)調(diào)節(jié)中有著關(guān)鍵的作用，是連接前腦邊緣系統(tǒng)和中腦單胺中心的中心樞紐［13］。刺激韁核能抑制5-羥色胺能中心中縫背核及中縫核( Dorsal Ｒaphe Nucleus，DＲN) 和多巴胺能中心腹側(cè)被蓋區(qū)( Ventral Tegmental Area，VTA) 的神經(jīng)元活
動［14-15］，對下游海馬也起到直接和間接的抑制作用。電針干預(yù)后，通過影響韁核的活性，使韁核的活性降低，繼而減少對下游腹側(cè)被蓋區(qū)、中縫核和中縫背核、海馬等核團(tuán)的抑制，從而相繼增加了β-CaMKⅡ在海馬中的表達(dá)，改善海馬突觸活性［16］，增加遞質(zhì)的釋放而起到**作用。多年的研究表明，針刺改善抑郁癥的機(jī)制是多靶向的復(fù)合作用［17］，但進(jìn)一步深入研究韁核-海馬關(guān)系在電針**抑郁癥中具有著深刻的意義。
