摘要: 目的考察靈芝孢子油對慢性輕度不可預(yù)見刺激模型小鼠行為學(xué)影響及可能的神經(jīng)生理機(jī)制。方法采用13 種不同慢性輕度不可預(yù)見刺激對雄性BALB/C 小鼠連續(xù)刺激建立小鼠抑郁模型。從第3 周開始連續(xù)灌胃給予3 個劑量的靈芝孢子油( 850、283、141. 5 mg·kg － 1 ) ，鹽酸氟西汀( 10 mg·kg － 1 ) 或空白溶媒( 植物油) 2 周后，測定各組小鼠行為學(xué)變化，同時采用反相高效液相色譜法( ＲP-HPLC) 測定海馬谷氨酸( GLU) 和γ-氨基丁酸( GABA) ，酶聯(lián)**法測定腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( BDNF)的含量。結(jié)果與模型組比較，靈芝孢子油能增加抑郁小鼠的體重、糖水偏好率和曠場實(shí)驗(yàn)得分( P ＜ 0. 01) ，縮短懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動時間( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，明顯降低海馬GLU 的含量( P ＜ 0. 01) ，增加BDNF 含量( P ＜ 0. 01) ，但對GABA 含量無影響( P ＞ 0. 05) 。結(jié)論靈芝孢子油對抑郁模型小鼠表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能與其降低GLU 和增加BDNF 相關(guān)。

關(guān)鍵詞: 靈芝孢子油; 慢性輕度不可預(yù)見刺激; 谷氨酸; γ-氨基丁酸; 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

抑郁癥( depression，DEP) 主要表現(xiàn)為情緒低落、行為遲緩和悲觀厭世等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生**行為。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，2020 年抑郁癥將成為僅次于心血管**的**大疾患。但用于**抑郁癥的**如三環(huán)類抗抑郁劑、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺再攝取抑制劑等，均有不同程度的副作用，如嗜睡、視物模糊、高血壓、驚厥和**低下等。因此，尋找**、副作用小的抗憂郁藥越來越引起人們的重視。

靈芝孢子油( ganoderma spore oil，GSO) 是從靈芝孢子中提取的脂質(zhì)活性物，含有靈芝孢子的主要有效成分如三萜類、核苷類及部分多糖類化合物等。沈志勇等研究鋁中毒小鼠發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶水平。但靈芝孢子油在抑郁方面的作用未見報道，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇私忪`芝孢子油的抗抑郁作用及其可能神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制。

1 材料

藥用植物油( 江西金源天然香料有限公司，批號: 20150116) ; 靈芝孢子油軟膠囊( 金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號: 20150201，0. 425 g) ，靈芝孢子油化學(xué)成分分析由本院天然**所提供: 總?cè)坪?9. 6%，不飽和脂肪酸占68. 42%; 鹽酸氟西汀( fluoxetine，F(xiàn)H，常州四藥制藥有限公司，批號:20150223) ; 實(shí)驗(yàn)前用0. 9%氯化鈉注射液配成所需濃度的溶液。

谷氨酸( glutamic acid，GLU) 對照品( 中國藥品生物制品檢定研究院，批號: 140624-200805，純度為100. 0% ) ; γ-氨基丁酸( gamma-aminobutyricacid，GABA，美國Sigma 公司，純度≥99. 0% ，批號: BCBG4279V) ; 正亮氨酸對照品( norleucine，Nle，北京百靈威科技有限公司，純度: 98% ，批號: L960N22 ) ; 對照品均用甲醇-水( 50∶ 50) 溶解并稀釋至所需濃度。異硫氰酸苯酯( 美國Sigma 公司，批號: BCBB1912V) ; 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( brain-derived neurotrophic factor，BDNF)測定試劑盒( 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號: 201505) 。

XＲ － XZ301 曠場實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，高30 cm，內(nèi)徑50 cm，被等分為面積相等的25 個等邊方格、SuperFst 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，規(guī)格為直徑為15 cm，高度為20 cm、SuperTst 高通量懸尾實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ;LC － 20AT 液相色譜系統(tǒng)( 包括自動進(jìn)樣器、紫外檢測器和工作站) ( 日本島津) ; X － 22Ｒ Centrifuge型高速低溫離心機(jī)( 美國Beckman 公司) ;TOLED0320 酸度計(jì)( 瑞士Mettler 公司) ; IKA T10勻漿機(jī)( 德國IKA 公司) 。

2 方法

2. 1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康雄性BALB /C 小鼠60 只，20 ～ 22 g［上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號SCXK( 滬) 20120002］。平衡飲食3 d 后隨機(jī)分為: ①空白對照組( blank) : 不刺激，并ig 給予藥用植物油; ②模型組( chronic unpredictable mild stress，CUMS) : 13種慢性刺激制作慢性輕度不可預(yù)知刺激模型( CUMS) ，并ig 給予藥用植物油; ③ 高劑量組( CUMS + GSO-H) : CUMS，并ig 給予靈芝孢子油850mg·kg － 1·d － 1 ) ; ④中劑量組( CUMS + GSO-M) :

CUMS，并ig 給予靈芝孢子油283 mg·kg － 1·d － 1 ;⑤低劑量組( CUMS + GSO-L) : CUMS，并ig 給予靈芝孢子油141. 5 mg·kg － 1·d － 1 ; ⑥陽性對照組:CUMS，并ig 給予氟西汀10 mg·kg － 1·d － 1。均常規(guī)飲水，造模第3 周開始給藥，連續(xù)給藥14 d。**給藥劑量根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)獲得。

2. 2 慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激模型的建立本實(shí)驗(yàn)采用Willer［5］抑郁模型方式造模。正

常組除外的5 組，每日給予不可預(yù)見應(yīng)激刺激，包括18 h 食物剝奪、4 h 噪音、10 min 閃光、15min 熱刺激( 45 ℃) 、2 h 制動、5 min 冷凍( 4℃) 、15 min 搖晃( 頻率1 次·s － 1 ) 、18 h 濕籠( 100 mL 水) 、1 min 夾尾、16 h 飲水剝奪、5 min游泳( 25 ℃) 、20 次電擊( 30 V，30 s) 、24 h 異物，以上刺激每天隨機(jī)安排1 種，同種刺激在整個實(shí)驗(yàn)周期中可出現(xiàn)多次，但不能連續(xù)出現(xiàn)，使動物不能預(yù)知刺激的發(fā)生，14 d 1 個循環(huán)，共造模28 d。每周測體質(zhì)量1 次。

2. 3 曠場實(shí)驗(yàn)( open field test，OFT)

在末次灌胃給藥1 h 后，每組取10 只動物，在室溫為25 ℃的安靜實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將小鼠小心放在自發(fā)活動曠場箱底中心，觀察5 min 內(nèi)活動情況。觀察指標(biāo)為: ① 水平穿行方格數(shù): 3 爪以上跨入鄰格或者重心落入; ② 豎直站立次數(shù): 前肢離開水平地面1 cm 以上的次數(shù)。分別計(jì)算水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分。每次做完實(shí)驗(yàn)后清理箱內(nèi)殘留物，**上1 只大鼠的氣味，以免影響下1只大鼠的行為。

2. 4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)( sucrose preference test，SPT)

實(shí)驗(yàn)開始前，在安靜的房間內(nèi)先訓(xùn)練小鼠適應(yīng)含糖飲水: 每籠同時放置2 個水瓶，第1 個24 h，2瓶均裝有1% 的蔗糖水; 第2 個24 h，一瓶裝有1%蔗糖水，另一瓶裝有蒸餾水。禁食禁水10 h 后，進(jìn)行小鼠的蔗糖飲水實(shí)驗(yàn)。同時給予每組小鼠事先定量好的1 瓶1% 蔗糖水，1瓶蒸餾水。1 h 后，取走2瓶水稱重，記錄每組的蔗糖水消耗量、蒸餾水消耗量以及總液體消耗量。于實(shí)驗(yàn)的第7、14、21、28 天各測量1 次。蔗糖水偏好度( %) = ( 蔗糖水消耗量/總液體消耗量) × 100%。

2. 5 小鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)( tails suspension test，TST)

于末次灌胃給藥l h 后，每組取10 只動物，在安靜無風(fēng)的室內(nèi)，將小鼠尾部距末端約2 cm 處，用醫(yī)用膠布粘貼固定在懸尾儀上，使小鼠呈倒掛狀態(tài)，兩側(cè)有黑色擋板隔開，遮擋小鼠視線，使其不受外界干擾懸掛6 min，記錄后4 min 內(nèi)小鼠累計(jì)不動時間( 指小鼠停止掙扎，身體呈垂直倒懸狀態(tài)，靜止不動) 。

2. 6 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)( forced swimming test，F(xiàn)ST)

于末次灌胃給藥l h 后，每組取10 只動物，將小鼠單獨(dú)放入強(qiáng)迫游泳儀的圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深10 cm，水溫( 25 ± 2) ℃，從小鼠入水后計(jì)時6min，記錄后4 min 內(nèi)游泳累計(jì)不動時間( 指小鼠在水中停止掙扎，或顯示漂浮狀態(tài)，僅有微小的肢體運(yùn)動以保持頭部浮在水面) 。每只動物做完后即換水。

2. 7 腦組織處理

冰浴下分離小鼠腦海馬，**稱重后1∶ 10 加入生理鹽水，冰浴下超聲裂解30 s; 在2 500 r·min － 14 ℃低溫離心30 min，取上清液0. 5 mL，加含100μmol·L － 1內(nèi)標(biāo)液2. 0% 高氯酸1 mL 混勻，14 000r·min － 1 4 ℃低溫離心30 min，取上清液作為樣品溶液。

2. 8 海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量測定

將海馬組織于4 ℃復(fù)溫，按1∶ 9 比例加入預(yù)冷50 mmol·L － 1醋酸緩沖液( pH 4. 75) ，勻漿后靜置5min，3 500 r·min － 1離心15 min，收集上清液作為樣品，按試劑盒說明測定。

2. 9 衍生劑配制及柱前衍生

衍生試劑為1 mol·L － 1 的三乙胺乙腈溶液: 取三乙胺139 μL，加乙腈861 μL，混勻; 0. 1 mol·L － 1異硫氰酸苯酯乙腈溶液: 取異硫氰酸苯酯12 μL，加乙腈988 μL，混勻。柱前衍生取氨基酸對照品溶液及樣品溶液200 μL，分別置1 mL 離心管中，加正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液( 100 μmol · L － 1 ) 10 μL，加入1 mol·L － 1三乙胺乙腈溶液100 μL，0. 1 mol·L － 1異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1h，加入400 μL 正己烷，放置10 min，取下層溶液，用水稀釋10 倍，用0. 45 μm 濾器過濾，進(jìn)樣10 μL;色譜條件: 色譜柱為Inertsil ODS-3 色譜柱( 4. 6mm × 250 mm，5 μm) ; 柱溫為40 ℃; 檢測波長為254 nm; 進(jìn)樣量為10 μL; 流動相A 為0. 1 mol·L － 1醋酸鈉溶液( 用乙酸調(diào)節(jié)pH 為6. 5) -乙腈( 95∶ 5) ，流動相B 為乙腈-水( 80 ∶ 20) ，梯度洗脫程序0 ～ 2min，100% A; 2 ～ 15 min，100% →90% A; 15 ～ 25min，90% →70% A; 25 ～ 33 min，70% →55% A;33 ～ 43 min，0% A; 43 ～ 53 min，100% A。

2. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)用孫瑞元DAS 軟件進(jìn)行單因素方差分析后，再進(jìn)行各組間均數(shù)兩兩比較分析，P ＜ 0. 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3. 1 靈芝孢子油對小鼠體重的影響與正常組比較，小鼠造模在第2 到3 周后體

重增加緩慢，第4 周甚至出現(xiàn)下降( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，說明小鼠在抑郁形成的過程中，可能影響消化系統(tǒng)功能，從而導(dǎo)致體重減輕。與模型組比較，陽性組和靈芝孢子油高劑量組小鼠的體重在3、4 周增加( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，在4 周時，小鼠的體重也都得到明顯改善( P ＜ 0. 05 ) ，結(jié)果見表1。

3. 2 靈芝孢子油對蔗糖水偏好的影響

與正常組比較，模型組和各給藥組小鼠造模14d 其糖水偏好率降低( P ＜ 0. 05) ，模型組在第3、4 周其糖水偏好率降低更顯著( P ＜ 0. 01 或0. 05) 。但給藥組小鼠在28d，除低劑量組偏低外，高、中劑量組基本達(dá)到正常組水平。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠14 d 差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但在第3、4 周其糖水偏好率明顯增高( P ＜ 0. 01 或0. 05) ，高劑量組基本達(dá)到陽性對照組水平，結(jié)果見表2。

3. 3 靈芝孢子油在小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的得分情況

與正常組比較，模型組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)得分顯著性降低( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，高、中劑量組和陽性對照組小鼠敞箱實(shí)驗(yàn)得分增加( P ＜ 0. 01 或P ＜ 0. 05) ，高劑量組基本達(dá)到陽性對照組水平。

3. 4 靈芝孢子油對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的不動時間的影響

與正常組比較，模型組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動時間明顯延長( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動時間縮短( P ＜ 0. 01或P ＜ 0. 05) 。結(jié)果見表3。

3. 5 靈芝孢子油對小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動時間的影響

與正常組比較，模型組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動時間明顯延長( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動時間縮短( P ＜ 0. 01) ，高、中劑量組基本達(dá)到正常水平，結(jié)果見表3。

3. 6 靈芝孢子油對小鼠海馬GLU、GABA 和BDNF的影響

與空白組比較，抑郁模型組大鼠海馬組織的GLU 含量升高，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明顯降低( P ＜ 0. 01 ) ，GABA 含量變化不明顯( P ＞ 0. 05 ) 。與抑郁模型組比較，各給藥組和陽性對照組小鼠GLU 含量明顯降低( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明顯升高( P ＜ 0. 01) ，高劑量組基本達(dá)到陽性對照組水平; 各給藥組和陽性對照組小鼠GABA 變化不明顯( P ＞ 0. 05) ，結(jié)果見表4。

4 討論

在本次實(shí)驗(yàn)中，給予抑郁小鼠靈芝孢子油后發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油能增加抑郁小鼠的糖水偏好率和敞箱實(shí)驗(yàn)得分，縮短TST 和FST 的不動時間，其效果與經(jīng)典的抗抑郁藥鹽酸氟西汀類似。這個結(jié)果表明靈芝孢子油具有抗抑郁作用。

本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組海馬GLU 含量明顯增加，BDNF 含量明顯降低，證實(shí)了GLU 和BDNF 在抑郁中的作用，這個結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致，這說明抑郁的發(fā)生與神經(jīng)***密切相關(guān)。同時分析了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA 含量的變化情況，在各實(shí)驗(yàn)組均沒有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這個結(jié)果支持Petty的結(jié)論。

在給予抑郁小鼠靈芝孢子油后發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油能明顯降低海馬GLU 含量，增加BDNF 含量，這個結(jié)果說明靈芝孢子油可能通過降低腦內(nèi)GLU 水平，從而降低興奮毒性，減少海馬神經(jīng)元損傷。另外，靈芝孢子油增加BDNF 含量，促進(jìn)神經(jīng)元再生，保護(hù)神經(jīng)元存活，有效防止發(fā)生神經(jīng)退行性病變，從而降低抑郁的發(fā)生。關(guān)于靈芝孢子油影響GLU 和BDNF 的機(jī)制，我們分析了靈芝孢子油的化學(xué)成分，總?cè)坪?9. 6%，不飽和脂肪酸占68. 42%。三萜類化合物能夠減少腦內(nèi)Glu。因而推測靈芝孢子油的降低海馬GLU 可能與其所含的三萜類化合物有關(guān)。長鏈多不飽和脂肪酸能促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖。因而推測靈芝孢子油的增加BDNF 含量與其所含的多不飽和脂肪酸有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)**證實(shí)了靈芝孢子油具有抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能是其通過降低抑郁小鼠海馬GLU 水平和增加BDNF 水平來發(fā)揮作用。