【摘要】 目的 評(píng)價(jià)烏司他丁預(yù)先給藥對(duì)異氟醚暴露致老年小鼠認(rèn)知功能障礙的影響。方法 健康雄性SPF 級(jí) C57BL /6 小鼠 36 只，18 月齡，體重 27 ～ 35 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對(duì)照組 ( C組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。I 組和 S 組暴露于 1% 異氟醚 3 h，連續(xù) 7 d; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。末次暴露結(jié)束后 24 h 進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)試，包括 Morris 水迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，測(cè)試完畢后立即處死小鼠取海馬，采用 ELISA 法測(cè)定白細(xì)胞介素 － 6( IL － 6) 、白細(xì)胞介素 － 1β( IL － 1β)和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量。結(jié)果 與 C 組比較，I 組逃避潛伏期延長(zhǎng)，原平臺(tái)停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)減少，曠場(chǎng)中心區(qū)停留時(shí)間縮短，海馬 IL － 1β、TNF－ α 含量升高( P ＜ 0. 05) ，S 組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0. 05) 。與 I 組比較，S 組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺(tái)停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)次數(shù)增多，曠場(chǎng)中心區(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，海馬 IL － 1β、TNF － α 含量降低( P ＜ 0. 05) 。結(jié)論 烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露所致老年小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與抑制海馬炎癥因子過(guò)度釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 異氟醚; 烏司他丁; 老年鼠; 認(rèn)知障礙; 海馬; 炎癥

術(shù)后認(rèn)知障礙( POCD) 是老年患者術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。研究表明，異氟醚可導(dǎo)致 POCD。因此探尋有效措施預(yù)防和**異氟醚導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙具有重要意義。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可減少炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放。研究表明，烏司他丁具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其能否有效地防治異氟醚所致認(rèn)知功能障礙尚不明確。本研究擬評(píng)價(jià)烏司他丁預(yù)先給藥對(duì)異氟醚暴露致認(rèn)知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 SPF 級(jí) C57BL /6 小鼠 36只，18 月齡，雄性，體重 27 ～ 35 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，于室內(nèi)溫度 22℃ ，濕度 50% ，12 h/12 h 晝夜明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對(duì)照組( C 組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。

1． 2 方法 參照文獻(xiàn)［4］的方法并加以改進(jìn)，將小鼠置于密閉麻醉箱中，頂蓋一小孔與氣體監(jiān)測(cè)儀的導(dǎo)管相通，持續(xù)監(jiān)測(cè)箱內(nèi)異氟醚、CO2和 O2的濃度。麻醉箱底部浸于 37℃ 的恒溫水浴箱中。I 組和 S 組暴露于1% 異氟醚( 批號(hào): 936245U，Abbott 公司，美國(guó)) 3 h，異氟醚以空氣( 21% 氧氣混合 79% 氮?dú)? 輸送，新鮮氣體流量 1. 5 L/min，連續(xù) 7 d; C 組吸入空氣 3 h; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。

1． 3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)（儀器均由上海欣軟信息科技有限公司提供） 末次暴露結(jié)束后 24 h 進(jìn)行 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，記錄小鼠游泳速率和潛伏期。在定位航行試驗(yàn)第 4 天完成之后行空間探索試驗(yàn)。此時(shí)平臺(tái)從第Ⅰ象限移除。小鼠從定位航行實(shí)驗(yàn)平臺(tái)放置象限相對(duì)的象限即第Ⅲ象限入水，每次進(jìn)入小鼠游泳 60 s 后停止。記錄目標(biāo)象限穿越次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。

曠場(chǎng)試驗(yàn)持續(xù) 3 d。從小鼠放置在中央格時(shí)計(jì)時(shí)，每次記錄 15 min。記錄中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、周邊區(qū)停留時(shí)間、總路程及平均速率。

1． 4 白細(xì)胞介素 － 6 ( IL － 6 ) 、白細(xì)胞介素 － 1β( IL －1β) 和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量測(cè)定 認(rèn)知功能測(cè)試完畢后立即處死小鼠，剝離雙側(cè)海馬組織，存于－ 80℃ 冰箱，采用 ELISA 法測(cè)定海馬 IL － 6、IL － 1β 和TNF － α 含量。稱重海馬，稀釋至 400 μL，按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及相對(duì)應(yīng)的吸光值( OD450值) 通過(guò) Curve Expert1． 3 軟件分析作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)得到樣品的，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計(jì)算海馬 IL － 6、IL － 1β 和 TNF － α 含量。

1． 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 16. 0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用成組 t 檢驗(yàn)。

3 討論

探討圍手術(shù)期 POCD 發(fā)生的原因，以及避免和防范 POCD 成為亟待解決的問(wèn)題。18 月齡的 C5 /7 小鼠相當(dāng)于人類中老年期，因此本研究選用 18 月齡鼠作為研究對(duì)象，以期了解異氟醚對(duì)老年鼠學(xué)習(xí)記憶的損害。根據(jù) ＲAMMES 的研 究，小 鼠 異 氟 醚 MAC 值 在( 1. 33 ± 0. 16) % ，因此本研究采用 1% 異氟醚濃度 3 h麻醉暴露方案。

Morris 水迷宮是應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究的一種實(shí)驗(yàn)手段，在學(xué)習(xí)記憶﹑新藥研發(fā)﹑海馬 /外海馬研究﹑藥理學(xué)﹑毒理學(xué)等應(yīng)用非常普遍。曠場(chǎng)試驗(yàn)是一種經(jīng)典評(píng)價(jià)動(dòng)物行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，主要反映?dòng)物在新環(huán)境的自主行為和探究行為。本研究中 Morris 水迷宮結(jié)果和曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果提示，I 組老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均較對(duì)照組降低，而 S 組與 C 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明烏司他丁可減輕異氟醚暴露所致老年小鼠學(xué)習(xí)探索和記憶能力的損傷。

本研究結(jié)果表明，烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露致老年小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與減少海馬炎性因子的過(guò)度釋放有關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞炎性因子( IL － 1β、TNF － α 和 IL － 6 等) 釋放能夠?qū)е抡J(rèn)知功能減退。炎性因子釋放可抑制海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，而海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是海馬學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵。另外，IL － 1β能夠激活 Caspase － 3，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，可通過(guò)IL － 1β / Caspase － 3 / 神經(jīng)凋亡途徑損害認(rèn)知功能。而烏司他丁能調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)，抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放、促進(jìn)**性細(xì)胞因子的釋放。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可有效抑制多種蛋白酶、糖苷酶、脂水解酶的活性。在膿毒癥、休克及心、肺、肝、腸的缺血再灌注損傷中，烏司他丁具有明顯的抑制炎癥因子釋放、保護(hù)組織臟器功能的作用。有研究表明在腦缺血再灌注模型的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，烏司他丁能夠減少腦缺血再灌注損傷。另一項(xiàng)研究證實(shí)，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，烏司他丁可抑制 IL － 1β、TNF － α 等炎癥因子釋放，拮**性因子造成的慢性神經(jīng)病理性疼痛。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，I 組海馬 IL － 1β 和 TNF － α 含量升高，提示

異氟醚麻醉可促進(jìn)老年小鼠海馬炎性反應(yīng)，導(dǎo)致其認(rèn)知功能降低。機(jī)制可能與異氟醚導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活 NF － κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)炎性反應(yīng)有關(guān)。而烏司他丁預(yù)先給藥組促炎性細(xì)胞因子IL － 1β、TNF － α 的濃度明顯降低，可明顯減輕與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知功能損傷。