摘要:目的 探討鷹嘴豆異黃酮提取物(CIE)對阿爾茨海默病(AD)炎癥模型大鼠記憶能力的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用脂多糖右側(cè)海馬注射制備 AD 模型,40 只 Wistar 大鼠隨機(jī)分為 CIE 高、中、低劑量組(100,50,25 mg·kg-1)、模型組和對照組(生理鹽水),灌胃給藥 28 d 后,采用 Y-迷宮測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,采用**組化法檢測大鼠海馬內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和細(xì)胞白介素-6(IL-6)的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較,模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,嘗試次數(shù)均明顯增加(P<0.01),TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)水平有顯著提高(P<0.01);經(jīng)過灌胃給藥不同劑量的 CIE 后,與模型組相比,大鼠學(xué)習(xí)記憶的嘗試次數(shù)和 TNF-α、IL-6 的表達(dá)水平有不同程度的降低,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,特別在中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。結(jié)論 CIE 對 AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的改善作用,其作用機(jī)制Y迷宮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響
可能與抑制模型大鼠海馬組織內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)有關(guān),進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)。
關(guān)鍵詞:鷹嘴豆異黃酮提取物;阿爾茨海默?。荒[瘤壞死因子-α;細(xì)胞白介素-6;海馬
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性**,其病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。有證據(jù)顯示,在 AD 發(fā)病初期及病程進(jìn)展過程中,海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)、神經(jīng)病理會發(fā)生一系列的變化,并在 AD 的發(fā)病與發(fā)展中具有重要作用。**神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)是 AD 的關(guān)鍵性特征之一,所涉及的多種炎性細(xì)胞因子加速了 AD 的整個(gè)病變過程,因此有研究提出,****可能延緩神經(jīng)元退行性病變的速度,或?qū)⒂欣诰徑?nbsp;AD 患者的癥狀。鷹嘴豆 Cicer arietinum L.屬于豆科,味甘、性平、無毒,具有補(bǔ)中**、溫腎**、潤肺止咳等功效。有研究表明,鷹嘴豆具有廣泛的藥理活性,包括保護(hù)心血管、抗腫瘤、調(diào)脂等功能,這與其含有的活性成分異黃酮有著密切的關(guān)系,如芒柄花黃素、雞豆黃素 A。更有研究顯示,鷹Y迷宮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響豆 異 黃 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract,CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其作用機(jī)制與其抗氧化能力有關(guān)。而 CIE 是否能通過影響 AD 病程的炎癥反應(yīng)及炎癥因子的表達(dá),從而緩解 AD 的癥狀,國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察 CIE 對 AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,并探討其可能的機(jī)制,為抗 AD 的**研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的研究思路。
1 材料
1.1 動(dòng)物
成年 Wistar 大鼠 40 只,♂,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號:SCXK(滬)2012-0002,清潔級,體質(zhì)量 200~250 g。
1.2 藥品、試劑與儀器
CIE 為自行制備,紫外分光光度法測得異黃酮含量為 39.0%;脂多糖(Sigma 公司,批號:B5-L2880),用生理鹽水配成 5 μg·μL-1的溶液;TNF-α(批號:20130917)、IL-6(批號:20131025)、非結(jié)合多克隆兔抗體(批號:20131025)、S-P 試劑盒(批號:20130818)及 DAB 顯色試劑盒(批號:20120320)均購自武漢博士德生物工程有限公司;UV-3100 紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司); XR-XY1031 Y-迷宮刺激器(上海欣軟信息科技有限公司);大鼠腦立體定位儀(美國 Stoelting 公司);JD801 圖像分析儀(江蘇捷達(dá)科技公司)。
2 方法
2.1 動(dòng)物分組與給藥
將 Wistar 大鼠,♂,隨機(jī)分為 5 組:CIE 高、中、低劑量組(100,50,25 mg·kg-1)、模型組和對照組,每組 8 只,安靜清潔環(huán)境下 4 只一籠飼養(yǎng),溫度控制在(25±1)℃,相對濕度 60%,正常飲食。造模手術(shù)后第 2 天開始,各試驗(yàn)組均灌胃給藥進(jìn)行干預(yù),每日 1 次,模型組和對照組給予等量的生理鹽水。
2.2 模型制備
采用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉,將其固定于腦立體定位儀上,剪去頭頂部毛發(fā),碘酊**后切開皮膚,參照《大鼠腦立體定位圖譜》選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū),于前囟后 1.0 mm,中線旁開 1.6 mm 處,用柔性顱骨鉆鉆開顱骨,暴露硬腦膜,用微量注射器緩慢自腦表面垂直進(jìn)針 3.4 mm,將 5 μg·μL1的脂多糖溶液緩慢注入,2 min 后將注射針緩慢抽出,用骨蠟封住鉆孔,縫合切口。對照組注射等量的生理鹽水。
2.3 Y-迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測試
大鼠連續(xù)灌胃給藥 28 d 后,采用 Y-型迷宮測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分 2 次進(jìn)行,每次測試固定在上午 8:00~12:00,測試環(huán)境應(yīng)保持安靜,避光。第 1 次為學(xué)習(xí)能力測試:訓(xùn)練前,將大鼠放入 Y-迷宮自由活動(dòng)適應(yīng) 5 min,適應(yīng)后將Ⅰ臂作為**臂,Ⅱ、Ⅲ臂給予 60 V,0.5~0.7 mA的電刺激,持續(xù) 2 s,以大鼠被電擊后一次性逃離至**臂為正確反應(yīng),否則判定為錯(cuò)誤反應(yīng)。之后的訓(xùn)練將**臂作為起始臂,將大鼠放置于**臂 1 min 加強(qiáng)記憶,**臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的順序依次改變,其他臂再次給予電刺激,依次類推,以測試達(dá)到連續(xù) 10 次中有 9 次正確反應(yīng)所需的電擊次數(shù)作為評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。第 2次為記憶能力測試:學(xué)習(xí)能力測試后 48 h 后,以同樣的方法測試,以測試達(dá)到連續(xù) 10 次中有 9 次正確反應(yīng)所需的電擊次數(shù)作為評價(jià)大鼠記憶能力的指標(biāo)。
2.4 取材方法和樣品制備
在 Y-型迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測試后,用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉,麻醉后剪開胸腔,使心臟暴露,將灌流針從大鼠的左心室插入至升主動(dòng)脈,剪開右心耳,并同時(shí)快速灌注 37 ℃的生理鹽水至流出液清亮,然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注結(jié)束后迅速端頭取腦,去除嗅球和小腦,將組織放入 4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行后固定 6 h。固定后修腦,取包含海馬組織的腦區(qū)經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后,切片備用,厚度為 4 μm。
2.5 大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)的檢測
大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)的檢測,按照博士德生物工程有限公司提供的**組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。切片制作完成后,每張切片隨機(jī)觀察 5 個(gè)高倍視野下的海馬區(qū)域,根據(jù) TNF-α和 IL-6 蛋白的表達(dá),利用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對視野進(jìn)行灰度值測定并記錄結(jié)果
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
計(jì)量資料以 x ± s表示,采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2 組間的比較采用 t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析及 Dunnett’s 檢驗(yàn)。
3 結(jié)果
3.1 CIE 對 AD 模型大鼠 Y-迷宮學(xué)習(xí)記憶能力的影響
在學(xué)習(xí)能力測試中,與對照組相比,模型組大鼠所需要的嘗試次數(shù)明顯增加(P<0.01),說明造模成功的 AD 大鼠學(xué)習(xí)能力降低。而灌胃給予不同劑量的 CIE 后,嘗試次數(shù)均有所下降,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,中、高劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。同樣在記憶能力測試中,模型組大鼠所需的嘗試次數(shù)明顯高于對照組(P<0.01),與模型組比較,不同劑量 CIE 組的嘗試次數(shù)均有所下降,50 和 100 mg·kg-1劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且具有一定的劑量相關(guān)性。Y迷宮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表達(dá)的影響
3.2 CIE 對 AD 模型大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)水平的影響
經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測試顯示,模型組大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著低于對照組(P<0.01),提示模型組大鼠海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性;CIE 各劑量組 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相對于模型組有一定的提高,說明TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)降低,且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。結(jié)果見表 2。
4 討論
AD 發(fā)病機(jī)制雖然復(fù)雜,但目前學(xué)界公認(rèn)炎性反應(yīng)在 AD 的發(fā)病過程中起著重要的作用。有國外研究顯示,大量 TNF-α 等炎性細(xì)胞因子會存在AD 的神經(jīng)病例過程中,異常高度表達(dá)的 TNF-α提示其可能與 AD 的發(fā)病有關(guān)。IL-6 是一種炎癥性細(xì)胞因子,處于 AD **神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的中心位置,參與 AD 患者炎癥級聯(lián)反應(yīng)的形成。Sokolova 等通過大量試驗(yàn)表明,IL-6 在 AD 患者腦組織中呈顯著上調(diào)趨勢,認(rèn)為 IL-6 具有神經(jīng)元毒性作用,參與 AD 的發(fā)病過程。與對照組相比,本研究中的模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶的嘗試次數(shù)明顯增加(P<0.01),海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著降低(P<0.01),提示表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性,說明AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低,**神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)明顯,進(jìn)一步證明了該模型的可靠,可以用于炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的 AD 研究。鷹嘴豆由于富含具有較強(qiáng)抗氧化活性的異黃酮類化合物,近幾年成為天然抗氧化劑開發(fā)的研究熱點(diǎn)。有研究表明,CIE 可能通過抗氧化機(jī)制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,而氧化應(yīng)激不僅直接參與了 AD 的發(fā)病機(jī)制,更重要的是通過其連接中介效應(yīng)放大了 AD 神經(jīng)炎性病變的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,CIE 各劑量組TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相對于模型組有一定的提高,提示海馬內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)降低,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或 P<0.01)。說明 CIE 對海馬組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生有一定的抑制作用,在一定程度上阻斷了 AD 模型大鼠海馬內(nèi)的炎癥損傷,而產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。然而,CIE 是通過何種機(jī)制和通路對 TNF-α、IL-6 等炎癥因子起
到精準(zhǔn)調(diào)控,需要進(jìn)一步地深入研究和探討。總之,CIE 對 AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用,其作用機(jī)制可能與抑制大鼠海馬組織內(nèi) TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)有關(guān),并進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)。