摘要: 目的 研究糖尿病發(fā)展過(guò)程中大鼠血漿 β-淀粉樣蛋白 42( amyloid beta 42，Aβ42) 、胰島素和血糖的動(dòng)態(tài)變化; 初步探討在糖尿病發(fā)展過(guò)程中胰島素和血糖對(duì) Aβ42 的影響，并分析糖尿病發(fā)展成為認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)。方法 腹腔注射鏈脲佐菌素( streptozotocin，STZ) 復(fù)制實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型，以血糖濃度≥16. 7 mmol·L－ 1確定模型成立。實(shí)驗(yàn)分為正常組與模型組。建模前后共采集5 次血液，每次間隔 15 d。建模 60 d，代謝籠測(cè)大鼠 24 h 食量、水量、尿量和糞便量; 建模 70 d，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠覓食時(shí)間、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)。用葡萄糖氧化酶法和酶聯(lián)**吸附法測(cè)血糖、胰島素和 Aβ42 的含量。結(jié)果 STZ 復(fù)制的糖尿病大鼠模型穩(wěn)定。模型組大鼠食量、水量、尿量和糞便量明顯高于對(duì)照組( P ＜0. 01) ; 八臂迷宮實(shí)驗(yàn): 與對(duì)照組比較，模型組大鼠覓食時(shí)間、參考記憶錯(cuò)誤頻率和平均探究時(shí)間均有顯著性差異( P ＜0. 05) ，工作記憶錯(cuò)誤頻率高于對(duì)照組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型成立初期 Aβ42 隨胰島素增多而降低，建模 45 d，Aβ42 含量*高，之后下降。結(jié)論 建模70 d，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于對(duì)照組，糖尿病大鼠患認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高; 糖尿病初期，模型成立 45 ～ 75 d，為給予**干預(yù)**的*佳時(shí)期; 臨床上可以通過(guò)同時(shí)檢測(cè)胰島素和 Aβ42 判斷糖尿病是否向認(rèn)知障礙發(fā)展。

關(guān)鍵詞: 糖尿病; β-淀粉樣蛋白 42; 胰島素; 血糖; 認(rèn)知障礙; 動(dòng)態(tài)變化

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)生率正以驚人的速度上升。根據(jù)世界衛(wèi)生組織( WHO) 報(bào)道，2006 年全世界約有 1. 8 億人患糖尿病，2007 年糖尿病患者人數(shù)增長(zhǎng)到 2. 46 億，如不進(jìn)行干預(yù)，這一數(shù)字到2030 年可能會(huì)增加一倍以上。目前我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò) 7000 萬(wàn)，成為繼腫瘤、心血管病之后的第三大嚴(yán)重威脅人們健康的慢性**。然而，全球超過(guò) 20 萬(wàn)人患有老年癡呆癥，到2040 年這一數(shù)字預(yù)計(jì)將超過(guò) 80 萬(wàn)。*近的一些證據(jù)表明，糖尿病和阿爾茨海默氏病( AD) 間有密切的關(guān)系。糖尿病被認(rèn)為是患老年癡呆癥包括阿爾茨海默氏病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。然而，這一風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制還不是很清楚。*近的幾項(xiàng)研究結(jié)果表明，胰島素和葡萄糖代謝紊亂增加患癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在 AD 患者中。腦脊液( cerebrospinal fluid，CSF) 中 β-淀 粉 樣 蛋 白( amyloid beta，Aβ) 的水平檢測(cè)對(duì)診斷 AD 的價(jià)值已被廣泛證實(shí)，其診斷 AD 的準(zhǔn)確率可達(dá) 80% ～90%。Aβ 的聚集和沉積在 AD 的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，并且 Aβ42 是聚集和沉積的核心。一些證據(jù)表明，胰島素和 Aβ 同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)胰島素降解酶( insulin degrading enzyme，IDE) ，并且 IDE 通過(guò)其他多肽底物優(yōu)先結(jié)合胰島素;另一方面，胰島素和影響胰島素水平的因素可能循環(huán)調(diào)解 Aβ 水平，并且 Aβ42 是 Aβ 聚集的核心。在臨床上，被診斷為 AD 患者的病程是不可逆的，無(wú)法**，并且在發(fā)生 AD 的過(guò)程中首先出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，發(fā)生認(rèn)知障礙是共性。因此，早期識(shí)別促進(jìn) AD 患者發(fā)病的病理，對(duì)降低 AD 的發(fā)展率是必要的。新進(jìn)研究報(bào)道，糖尿病發(fā)生時(shí)，血糖和胰島素代謝紊亂，促進(jìn) AD 的發(fā)生，但是在糖尿病發(fā)展到什么程度才能促進(jìn) AD 發(fā)生的連續(xù)研究至今未見報(bào)道。因此作者在本實(shí)驗(yàn)中選擇糖尿病大鼠作為研究對(duì)象，觀察在糖尿病發(fā)展成為認(rèn)知障礙整個(gè)過(guò)程中相關(guān)生物標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化，希望在糖尿病早期的發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)監(jiān)測(cè)血液中相關(guān)生物標(biāo)記物的變化及其相關(guān)性來(lái)檢測(cè)糖尿病大鼠患認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)，并確定*佳**時(shí)期。

1 儀器和材料

XR-XB102 八臂迷宮( 上海欣軟信息科技有限公司) ，ＲT-6000 酶標(biāo)儀( 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司) ，LDZ5-2 低速自動(dòng)平衡離心機(jī)( 北京醫(yī)用離心機(jī)廠) ，UV-2102C 紫外分光光度計(jì)( 尤尼柯( 上海) 儀器有限公司) ，FA1004 分析天平( 上海越平科學(xué)儀器有限公司) ，微量移液器( 美國(guó) METTLEＲ TOLEDO 公司) ，DGG-9140B 電熱恒溫古風(fēng)干燥箱( 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司) 。鏈脲佐菌素( 美國(guó) Sigma 公司，批號(hào) S0130) ，葡萄糖測(cè)定試劑盒( 長(zhǎng)春匯力生物科技有限公司，批號(hào) 20120908) ，Aβ42 酶聯(lián)**試劑盒( 批號(hào)20120826 ) 、胰 島 素 酶 聯(lián) 免 疫 試 劑 盒 ( 批 號(hào)20120922) ( 上海藍(lán)基( BG) 生物科技有限公司) 。Wistar 大鼠，雄性，30 只，體質(zhì)量 ( 200 ±20) g，清潔級(jí)，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK( 京) 2012-0001。

2 方法

2. 1 糖尿病大鼠模型的復(fù)制

篩選空腹血糖正常的健康雄性 Wistar 大鼠20 只，禁食不禁水 16 h，以 62 mg·kg－ 1的劑量1 次性腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 鏈脲佐菌素檸檬酸 － 檸 檬 酸 鈉 緩 沖 液 ( pH 值 為 4. 5，用0. 1 mol·L－ 1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中新鮮配制) ，72 h 后測(cè)定靜脈血糖濃度，以隨機(jī)血糖濃度≥16. 7 mmol·L－ 1確定為糖尿病模型。

2. 2 分組

將大鼠按成模前體質(zhì)量、血糖水平隨機(jī)分為對(duì)照組( n = 10) 和模型組( n = 10) 。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2. 3 動(dòng)物血漿的制備

采用大鼠眼底靜脈叢取血，建模前采集血液1 次，建模后除*后一次間隔 30 d 外其他每間隔15 d 采集，共采集 5 次，3 000 r·min－ 1離心10 min，吸取上清，－ 80 ℃ 保存，待測(cè)。

2. 4 血糖、胰島素和 Aβ42 的測(cè)定

血糖采用葡萄糖氧化酶法，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。胰島素和 Aβ42 采用 BG 公司胰島素和Aβ42 酶聯(lián)**試劑盒測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 5 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境 2 d 后，稱質(zhì)量，連續(xù)訓(xùn)練14 d，訓(xùn)練結(jié)束后限制性給予正常飼料。據(jù)體質(zhì)量不同，給予大鼠 16 ～ 20 g 飼料，使體質(zhì)量保持在正常進(jìn)食大鼠的 80% ～ 85%。第 15 天測(cè)定，記錄以下 4 個(gè)指標(biāo): 工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)( workingmemory errors) ，用來(lái)評(píng)價(jià)短期記憶; 參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)( reference memory errors ) ，用來(lái)評(píng)價(jià)長(zhǎng)期記憶; 總的入臂次數(shù)及測(cè)試時(shí)間，用來(lái)評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)量。

2. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以珋x ± s 表示，用 SPSS 16. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析; 組間采用 t 檢驗(yàn)，P ＜0. 05 有顯著性差異，P ＜ 0. 01 有非常顯著性差異。糖尿病發(fā)展過(guò)程中大鼠血漿主要生物標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化。

3 結(jié)果

3. 1 體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化

建模成功后，正常飼料喂養(yǎng)糖尿病大鼠，糖尿病大鼠體質(zhì)量下降。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量，糖尿病大鼠與對(duì)照組比較有非常顯著性差異( P ＜0. 01) 。結(jié)果見表 1。

3. 2 一般指標(biāo)的測(cè)定

建模 60 d 后，以每 100 g 大鼠每天代謝量為標(biāo)準(zhǔn)。代謝籠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠食量、水量、尿量和糞便量明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性( P ＜0.01) ，表明建模60 d 模型穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

3. 3 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)

建模70 d，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠覓食時(shí)間、參考記憶錯(cuò)誤頻率和平均探究時(shí)間明顯高于對(duì)照組，并有顯著性差異( P ＜0. 05) ; 工作記憶錯(cuò)誤頻率高于對(duì)照組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表 3。

3. 4 血糖的動(dòng)態(tài)變化

在糖尿病發(fā)展過(guò)程中，持續(xù)檢測(cè)血糖水平，模型組血糖明顯高于對(duì)照組，并有非常顯著性差異( P ＜0. 01) ，說(shuō)明糖尿病大鼠模型穩(wěn)定。糖尿病發(fā)展過(guò)程中大鼠血漿主要生物標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化

3. 5 大鼠血漿中胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

成模 0 ～30 d，血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)持續(xù)性升高，說(shuō)明糖尿病大鼠處于胰島素抵抗階段; 成模 30 ～45 d，血糖下降，胰島素和胰島素抵抗指數(shù)繼續(xù)升高，糖尿病大鼠仍然處于胰島素抵抗階段; 成模 45 ～ 75 d，血糖顯著性升高，胰島素生成減少，胰島素抵抗指數(shù)明顯下降，并且胰島素生成量低于 0 點(diǎn)。結(jié)果見圖 2、3。3. 6 Aβ42 的動(dòng)態(tài)變化成模 15 d，模型組血糖和胰島素水平增高，Aβ42 水平降低; 15 ～ 45 d，胰島素和 Aβ42 水平均升高; 45 ～75 d，胰島素和 Aβ42 水平均降低。結(jié)果見圖 4。

a． STZ 選擇性損傷分泌胰島素的胰島 β 細(xì)胞，選用 STZ 建立糖尿病大鼠模型穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)創(chuàng)傷，成模后易護(hù)理。

b． 在建模第 60 天，進(jìn)行代謝籠實(shí)驗(yàn)，測(cè)定飲食量、飲水量、尿量和糞便量。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，模型組與對(duì)照組比較有顯著性差異，說(shuō)明模型穩(wěn)定。建模每隔 15 d 測(cè)模型組大鼠血糖，與對(duì)照組比較均有顯著性差異。研究表明，持續(xù)高血糖可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。長(zhǎng)期慢性的高血糖可顯著產(chǎn)生“糖毒性”，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生淀粉樣蛋白、糖基化產(chǎn)物、活性氧等有害物質(zhì)，損傷神經(jīng)元細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。

c． 建模 70 d 進(jìn)行八臂迷宮試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠覓食時(shí)間、參考記憶錯(cuò)誤頻率和平均探究時(shí)間均有顯著性差異;工作記憶錯(cuò)誤頻率高于對(duì)照組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明模型組大鼠與對(duì)照組大鼠短期記憶無(wú)差異，而長(zhǎng)期記憶有差異，并且模型組大鼠運(yùn)動(dòng)活性降低。證實(shí)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。同時(shí)還觀察到模型組大鼠多出現(xiàn)精神不振、萎靡和反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。

d． 糖尿病大鼠成模 0 ～ 15 d，血糖和胰島素含量增多，胰島素抵抗指數(shù)增高，Aβ42 水平降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異，屬于胰島素抵抗階段?？赡苁怯捎?nbsp;IDE 生成量隨著胰島素的增多代償性增多，此時(shí)處于胰島素抵抗初期，并且 IDE可以降解 Aβ42，所以 Aβ42 隨著 IDE 的生成增多而減少。成模15 ～45 d，血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平繼續(xù)增高，Aβ42 含量增多。雖然 IDE隨著胰島素的增多代償性增多，但由于 IDE 優(yōu)先選擇胰島素，且生成量有限，因此血中 Aβ42 隨胰島素的增多而增多，并且變化幅度大于胰島素。成模45 ～75 d，血糖升高，胰島素和胰島素抵抗指數(shù)降低，此期間胰島素生成量降低，屬于原發(fā)性胰島素生成減少，IDE 隨著胰島素的降低負(fù)反饋生成減少，Aβ42 降解減少，含量理應(yīng)不變或增多，但血中 Aβ42 水平降低，說(shuō)明此時(shí)血中 Aβ42 出現(xiàn)沉積。結(jié)合八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，糖尿病大鼠在 70 d 出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，精神萎靡，說(shuō)明在造模 70 d時(shí)糖尿病大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的變化，結(jié)合 Aβ42在 45 ～ 75 d 水平下降、出現(xiàn)沉積推測(cè)，糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與 Aβ42 出現(xiàn)沉積有關(guān)，而對(duì)照組沒(méi)有顯著性變化，因此糖尿病大鼠患認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于對(duì)照組。

e． 研究結(jié)果表明，糖尿病成模 45 d 時(shí)，大鼠血漿中胰島素和 Aβ42 水平達(dá)到*高峰，之后水平下降，并且在 70 d 時(shí)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，推測(cè)此時(shí) Aβ42 出現(xiàn)沉積。無(wú)論胰島素增多還是減少都影響 Aβ42 的水平。因此糖尿病向認(rèn)知轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期是糖尿病成模45 ～75 d。單一指標(biāo)不能有效說(shuō)明認(rèn)知問(wèn)題，臨床沒(méi)有八臂迷宮，所以臨床需結(jié)合認(rèn)知評(píng)價(jià)量表和觀察病人狀態(tài)同時(shí)監(jiān)測(cè)血中胰島素和 Aβ42 變化判斷糖尿病是否向認(rèn)知障礙發(fā)展—認(rèn)知出現(xiàn)障礙，精神不振、萎靡、反應(yīng)遲鈍，并出現(xiàn)胰島素和 Aβ42 水平急劇下降。在糖尿病初期( 大鼠成模 45 ～75 d 時(shí)) 給予干預(yù)**，是防止糖尿病向認(rèn)知障礙發(fā)展的*好時(shí)機(jī)，從而抑制糖尿病向認(rèn)知障礙發(fā)展。