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【上海欣軟整理】捕食應(yīng)激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

【上海欣軟整理】捕食應(yīng)激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

摘要

目的:探討嚴(yán)重心理應(yīng)激是否可引發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠較長時間的情緒喚醒水平障礙,以建立較理想的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型。

方法:實(shí)驗(yàn)于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都**成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135成組設(shè)計(jì)隨機(jī)分為捕食應(yīng)激組75 只和正常對照組60 只。先將大鼠放入捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱的小籠中,再將一只饑餓的貓放入實(shí)驗(yàn)箱中,使貓與大鼠無生理傷害性接觸,致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)潞粑贝俣焖俦且砩縿?/span>68 min;正常對照組大鼠除不接觸貓外,其他處理程序相同。并通過大鼠運(yùn)動活性、探究行為、拒俘反應(yīng)性和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀測應(yīng)激后4個月內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒水平改變,同時以Morris 水迷宮法檢測其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。采用SPSS 9.0 軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析,以及各組均數(shù)的SN-K法和Tamhanes T2 法檢驗(yàn)。

結(jié)果:參與實(shí)驗(yàn)大鼠135只在實(shí)驗(yàn)過程中無死亡,均進(jìn)入結(jié)果分析。①與正常對照組相比,捕食應(yīng)激后1個月內(nèi)應(yīng)激大鼠曠場爬越行為明顯減少[71.5±13.5),(96.8±18.4)分,P < 0.05];個月時后肢性站立仍明顯減少[11.4±2.1),(17.9±3.3)分,P < 0.05]。②與正常對照組相比,高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低[(4.8±0.9)%,(20.7±3.7)%,P < 0.01];[(0.9±0.2)%,(6.6±1.2)%,P < 0.01]。③與正常對照組相比,拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后個月內(nèi)明顯增加[2.4±0.5),(1.5±0.4)分,P < 0.05]。④與正常對照組相比,捕食應(yīng)激后第天應(yīng)激大鼠在Morris 水迷宮空間覓向訓(xùn)練中潛伏期明顯延長訓(xùn)練15 次時為(32±6)(17±3) s,P < 0.05],在空間定向能力測試時應(yīng)激大鼠水迷宮的4個象限中無目的漫游所花費(fèi)時間百分比差異無顯著性意義。應(yīng)激后周時大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力測試無明顯改變。

結(jié)論:單純捕食應(yīng)激成功誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)性運(yùn)動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙,以及短期空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知能力受損表現(xiàn),具有與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相似的致病因素與過程,可基本模擬其主要臨床表現(xiàn)。

主題詞:應(yīng)激障礙,創(chuàng)傷后;捕食應(yīng)激;情緒喚醒;動物模型

材料和方法

設(shè)計(jì):隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。

單位:解放軍成都**成都總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。

材料:實(shí)驗(yàn)于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都**成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135 只,實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量(185±9g,由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:scxk-(軍)2002008)。12 h 光亮/黑暗條件、2225 ℃ 環(huán)

境溫度,分隔喂養(yǎng)。成組設(shè)計(jì)隨機(jī)數(shù)字表法分為捕食應(yīng)激組75 只及正常對照組60 只。

儀器:按文獻(xiàn)自制捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱(1 m×1 m×1 m 鐵絲籠,中間放置20 cm×15 cm×15 cm 小鐵絲籠,便于實(shí)驗(yàn)時將大鼠放入其中)。按文獻(xiàn)[5, 6]自制曠場行為觀察箱(60 cm×60 cm×60 cm 的無頂木盒,箱底用墨線分為36 個等份小方格。用于大鼠情緒喚醒水平檢測)。按文獻(xiàn)[7]制備高架十字迷宮(木質(zhì)結(jié)構(gòu),包括50 cm×10 cm 的相對開臂和50 cm×10 cm ×40 cm的相對閉臂,閉臂的上部是敞開的。迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部。迷宮離地面50 cm。用于評價大鼠焦慮樣行為改變)。按文獻(xiàn)[8]制備Morris水迷宮(直徑1.2 m、高0.5 m 的圓桶,劃為個象限(按順時針方向定義為A、B、C、D),盛水后按0.5%1.5%比例加入奶粉,使水成為不透明的乳白色,水溫控制于2225 ℃。將直徑11 cm平臺固定于某一象限(本實(shí)驗(yàn)中置于象限),平臺在水平面下1 cm。用于空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察)。

設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者:設(shè)計(jì)為**作者,資料收集為**、二、三作者,實(shí)施為**、二、三、四作者,評估為**、五作者。實(shí)驗(yàn)實(shí)施前所有參與者均經(jīng)過相關(guān)專業(yè)統(tǒng)一培訓(xùn)。

方法:

模型制備:先將大鼠放入捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)箱的小籠中,再將1只饑餓的貓放入實(shí)驗(yàn)箱中,使貓與大鼠無生理傷害性接觸,致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)潞粑贝俣焖俦且砩縿?/font>68 min,以確保實(shí)驗(yàn)大鼠相似的應(yīng)激強(qiáng)度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng)。正常對照組大鼠除不接觸貓外,其他處理程序相同。

情感行為觀察:于捕食應(yīng)激后1,14 d,1,個月時分別取正常對照組及捕食應(yīng)激組大鼠各12、15只,觀察其情感行為改變:①大鼠運(yùn)動活性:將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱中央小方格內(nèi),觀測5 min 內(nèi)動物的活動情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1 /2 以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格,即爬越次計(jì)分,所得總分用于評價其運(yùn)動活性改變。②探究行為:方法同上,觀察5 min內(nèi)大鼠后肢性站立計(jì)分改變。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):后肢性站立1次計(jì)1分,總分用于評價其探究行為改變。③拒俘反應(yīng)性:以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠,觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn):很容易抓取動物;尖叫或回避;尖叫并回避;逃脫;逃脫并尖叫;咬或試圖撕咬手套;6主動躍起攻擊;以此評價動物恐懼與沖突素質(zhì)特征改變[6]。④高架十字迷宮實(shí)驗(yàn):將大鼠置于迷宮中央,頭朝閉臂。分別記錄5 min 內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時間(以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn)),計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時間分別占總次數(shù)(進(jìn)入開臂與閉臂次數(shù)之和)及總時間(在開臂與閉臂滯留時間之和)的百分比,以此為評價焦慮指標(biāo)。

空間學(xué)習(xí)和記憶能力觀察:采用Morris 水迷宮法[8],觀察捕食應(yīng)激后第天,周時空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改變。第1天為空間覓向訓(xùn)練:第天訓(xùn)練次,2 min /次,記錄大鼠從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間為訓(xùn)練潛伏期,每次的均值作為平均訓(xùn)練潛伏期;第天重復(fù)進(jìn)行次訓(xùn)練;比較所得的個平均訓(xùn)練潛伏期變化以分析動物獲取空間信息的能力。第天進(jìn)行空間定向能力測試:先將平臺移去,再將大鼠放入水中2 min,記錄它在四個象限中停留時間的百分比,以判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

主要觀察指標(biāo):大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時間、Morris 水迷宮平均訓(xùn)練潛伏期及不同象限停留時間百分比。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:由成都**成都總醫(yī)院信息科統(tǒng)計(jì)室采用SPSS 9.0 軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析,以及各組均數(shù)的S- N- K法(用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應(yīng)及開臂次數(shù)百分比的比較)和TamhanesT2法檢驗(yàn)(用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時間百分比及空間學(xué)習(xí)和記憶能力改變的比較)。

結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析參與實(shí)驗(yàn)大鼠135只在實(shí)驗(yàn)過程中無死亡,均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間情感行為觀察結(jié)果

2.2.1 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間曠場行為改變和高架十字迷宮行為改變結(jié)果。

顯示,捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個月內(nèi)曠場爬越行為明顯減少,顯示其運(yùn)動活性降低,之后漸恢復(fù)正常;而4個月時后肢性站立仍顯著減少,表明其探究行為明顯降低。捕食應(yīng)激后個月內(nèi),應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低,并于應(yīng)激后個月時稍有恢復(fù),但2個月后則進(jìn)一步降低。

2.2.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時間拒俘反應(yīng)性結(jié)果見表2。大鼠拒俘反應(yīng)性在應(yīng)激后2個月內(nèi)明顯增強(qiáng)。

討論【上海欣軟整理】捕食應(yīng)激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙臨床表現(xiàn)多樣,包括反復(fù)重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗(yàn)癥狀,情感麻木與回避癥狀,警覺過強(qiáng)所致持續(xù)性焦慮、驚恐逃避反應(yīng)及易激惹癥狀等癥候群。作者的前期工作分別建立了海馬驚厥閾下電刺激和大鼠加強(qiáng)捕食應(yīng)激兩種創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型。雖然二者均可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠造型后1個月內(nèi)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣行為異常,但由于前者很難排除電刺激等影響因素的作用,且與創(chuàng)傷后應(yīng)急障礙的致病因素亦有較大差異;而后者采用了捕食應(yīng)激與再次環(huán)境刺激相結(jié)合的方法,很難排除2次應(yīng)激效應(yīng)的影響;同時,兩種模型觀察時間有限,且所用行為學(xué)研究方法的定量、定性分析不足,難以排除研究者主觀因素的影響;因此,有必要進(jìn)一步改進(jìn)應(yīng)激模式、控制應(yīng)激強(qiáng)度,以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠更長時程的應(yīng)激相關(guān)情感行為異常,并定量分析相關(guān)情緒喚醒障礙的性質(zhì)。

鑒于應(yīng)激因素與強(qiáng)度,以及受害者當(dāng)時的極度無助感在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病中有重要意義,利用動物食物鏈中特殊的捕食行為,模擬與之相似的致病因素和過程。同時,通過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),捕食應(yīng)激49 min即可引發(fā)大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動,以及因驚嚇?biāo)潞粑贝俣焖俦且砩縿樱掷m(xù)這種驚嚇狀態(tài)68 min(即總體應(yīng)激時間在1117 min)時,可確保實(shí)驗(yàn)大鼠基本相似的應(yīng)激強(qiáng)度及穩(wěn)定的應(yīng)激效應(yīng);更有趣的是,此時的應(yīng)激效應(yīng)亦可能*佳,并由此引發(fā)了實(shí)驗(yàn)大鼠在個月的觀察時間內(nèi)存在明顯的情感行為障礙;而應(yīng)激不足或過強(qiáng)、持續(xù)時間過短或過長,似均難以達(dá)到類似的效應(yīng),但應(yīng)激方式和強(qiáng)度與應(yīng)激相關(guān)情感行為異常間的關(guān)系尚不能確定,有待進(jìn)一步探討。

曠場行為觀察是檢測實(shí)驗(yàn)動物情緒喚醒水平的一種重要方法。動物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護(hù)性情感反應(yīng),這對于量化分析實(shí)驗(yàn)動物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,捕食應(yīng)激大鼠應(yīng)激后1個月內(nèi)曠場爬越行為明顯減少,提示其新環(huán)境中運(yùn)動活性顯著降低;拒俘反應(yīng)性則在應(yīng)激后2個月內(nèi)顯著增強(qiáng),顯示其受驚嚇程度嚴(yán)重、沖突特性增強(qiáng)、易激惹、掙扎行為明顯;而4個月時后肢性站立仍顯著減少,表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,捕食應(yīng)激可致實(shí)驗(yàn)大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應(yīng)能力顯著下降,在應(yīng)激刺激后較長時間內(nèi)一直處于驚恐逃避情感反應(yīng)中。

高架十字迷宮試驗(yàn)則是利用動物對新異環(huán)境的探究特性,以及對高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評價實(shí)驗(yàn)動物焦慮素質(zhì)特征的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,捕食應(yīng)激后4個月內(nèi),應(yīng)激大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低,提示捕食應(yīng)激對大鼠有明顯的長時間的致焦慮效應(yīng);有趣的是,實(shí)驗(yàn)大鼠焦慮情緒于應(yīng)激后周內(nèi)進(jìn)行性加重,1個月時有所緩解,但2個月后則再次進(jìn)一步加重,顯示嚴(yán)重心理應(yīng)激所致實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒障礙可能主要以焦慮相關(guān)行為為特征,與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者極為相似,具體原因尚待進(jìn)一步探討。

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型,能較準(zhǔn)確地反映動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在Morris 水迷宮的空間覓向訓(xùn)練期,捕食應(yīng)激后1 d 應(yīng)激大鼠較正常對照組花費(fèi)更多的時間以找尋平臺,顯示其學(xué)習(xí)和記憶的獲得與鞏固過程受到影響;而在空間定向能力測試期,應(yīng)激大鼠空間定向能力亦明顯受損,顯示捕食應(yīng)激可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物記憶過程的不穩(wěn)定性,且對己儲存記憶的讀出或提取過程可能也有一定影響。而實(shí)驗(yàn)后2周時兩組動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力并無明顯差異,提示嚴(yán)重心理應(yīng)激只引發(fā)了實(shí)驗(yàn)動物短期的學(xué)習(xí)和記憶能力受損,與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者存在的短暫認(rèn)知功能受損頗

為相似。

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