摘要
應(yīng)激是機(jī)體對機(jī)體外界或機(jī)體內(nèi)部各種刺激產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。適度應(yīng) 激可提高機(jī)體的反應(yīng)能力和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；過度應(yīng)激則會對人體產(chǎn)生危害，導(dǎo)致機(jī)體 神經(jīng)***和心理的變化。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，工作和生活負(fù)擔(dān)的加重，人們 面臨的工作壓力及心理壓力越來越大。越來越多的證據(jù)表明，慢性應(yīng)激是人類多種重大疾 病的重要病因和誘因，能引發(fā)多種重大ji病，如腫瘤、心血管ji病、焦慮癥、抑郁癥、阿 爾茨海默病（Alzheimer抯 disease, AD)等軀體和精神ji病。
軍人作為一個特殊群體，面臨著復(fù)雜而強(qiáng)烈的**應(yīng)激因素，如生存環(huán)境惡劣、精神 高度緊張及**作業(yè)任務(wù)繁重等。強(qiáng)烈的**應(yīng)激因素不僅會對軍人健康造成直接危害， 還將產(chǎn)生嚴(yán)重的體力、腦力和心理損害，是造成**作業(yè)能力降低和非戰(zhàn)斗性減員的重要 因素。因此，**應(yīng)激損傷防護(hù)措施的研究是近年來各國**的研究重點(diǎn)。目前對于** 應(yīng)激主要以心理干預(yù)和補(bǔ)充氨基酸和維生素對應(yīng)激損傷進(jìn)行防治，但起效時間較慢，效果 有限。
己有研究表明，無論何種原因引起的應(yīng)激，其病理生理學(xué)變化均是神經(jīng)***免yi調(diào) 節(jié)（Neuroendocrine-immune network, NIM)網(wǎng)絡(luò)的平衡失調(diào)。現(xiàn)代應(yīng)激理論認(rèn)為，NINOS 絡(luò)是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境及生理功能平衡和穩(wěn)定的基礎(chǔ)，該觀點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)中的“陰陽氣血、臟 腑機(jī)能”平衡的整體觀是高度一致的。因此依據(jù)中醫(yī)整體觀、辨證觀、平衡觀以及現(xiàn)代應(yīng) 激理論，探討采用中醫(yī)藥手段干預(yù)應(yīng)激的方法和途徑、從中藥中尋找或創(chuàng)制防治應(yīng)激損害 的藥wu是一個具苻良好前景的研究方向。
六味地黃苷糖（LW-AFC)是靠前來源于六味地黃湯，由多糖、寡糖和糖苷三個活性 成分群組成的中藥5類新藥。前期研宂結(jié)果表明，LW-AFC對多種原因所致NIM紊亂具有 明顯調(diào)節(jié)作用，同時具有改善急性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷和AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 的作用。但是對于LW-AFC能否改善慢性應(yīng)激所致的情緒和認(rèn)知損傷，尚不明確。
因此，本課題根據(jù)**應(yīng)激源的多樣性和應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜性，針對**應(yīng)激*常遇到 的問題：飲水缺乏、睡眠剝奪、狹小戰(zhàn)斗空間和對未來不可預(yù)計(jì)的緊張心理，首先建立單 因素應(yīng)激（空瓶刺激模型、睡眠剝奪應(yīng)激動物模型、束縛應(yīng)激動物模型）和慢性多重應(yīng)激 動物模型模擬這幾種應(yīng)激狀態(tài)，并觀察不同**應(yīng)激模式和不同**應(yīng)激負(fù)荷對情緒和認(rèn) 知功能的影響及特點(diǎn)，繼而研宄LW-AFC對慢性應(yīng)激所致焦慮、抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能 力損傷的作用，*后探討LW-AFC改善慢性應(yīng)激致情緒和認(rèn)知損傷的作用機(jī)制。
**章LW-AFC對單因素應(yīng)激小鼠情緒的影響
采用不確定性空瓶飲水刺激法、睡眠剝奪應(yīng)激法和束縛應(yīng)激法分別模擬**應(yīng)激中飲 水缺乏、睡眠缺失及狹小空間的常見現(xiàn)象，觀察單因素應(yīng)激對小鼠情緒的影響及LW-AFC 的改善作用。
1.空瓶刺激法對小鼠焦慮樣行為的影響
采用每天給予小鼠一次空瓶刺激，lOmin/次，連續(xù)14d，建立不確定性空瓶飲水刺激 模型。結(jié)果表明，與空白對照組相比，空瓶刺激組和生理應(yīng)激組小鼠體重在空瓶刺激7 d 和14d后均顯著下降；曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空瓶刺激小鼠自主活動顯著升高，在中央?yún)^(qū)停 留時間有下降的趨勢；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，定時飲水組小鼠在開放臂內(nèi)停留時間 顯著減少，進(jìn)入開放臂的次數(shù)有下降趨勢。與定時飲水組相比，空瓶刺激組和生理應(yīng)激組 小鼠體重在空瓶刺激7 d后顯著下降；曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空瓶刺激小鼠自主活動無明顯 變化，在中央?yún)^(qū)停留時間有下降的趨勢；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空瓶刺激小鼠進(jìn)入 開放臂的次數(shù)和在開放臂內(nèi)停留時間均無明顯變化。上述結(jié)果提示，空瓶刺激14d小鼠未 出現(xiàn)焦慮情緒?，單純性缺水和單籠飼養(yǎng)可對小鼠行為產(chǎn)生較大影響。
2. LW-AFC對睡眠剝奪小鼠焦慮樣行為的影響
采用改良平臺法對小鼠連續(xù)睡眠剝奪96h，建立睡眠剝奪模型。結(jié)果表明，與正常對 照組相比，大平臺對照組小鼠體重顯著下降，提示實(shí)驗(yàn)未排除水環(huán)境對小鼠體重產(chǎn)生的影 響；與大平臺對照組相比，睡眠剝奪組小鼠體重顯著下降，LW-AFC對小鼠體重?zé)o明顯改 善作用。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組相比，大平臺對照組小鼠在曠場中運(yùn)動總距離 顯著增加，在曠場中央?yún)^(qū)停留時間無明顯變化；與大平臺對照組相比，睡眠剝奪小歐在曠 場中運(yùn)動總距離顯著降低，在曠場中央?yún)^(qū)停留時間顯著降低；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 與正常對照組相比，大平臺對照組小鼠在開放臂中停留時間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)均無明顯 變化；與大平臺對照組相比，睡眠剝奪小鼠在開放臂中停留時間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)均顯 著降低；LW-AFC具有增加小鼠自主活動、在曠場中央?yún)^(qū)停留時間和進(jìn)入開放臂次數(shù)的趨 勢。上述結(jié)果提示，睡眠剝奪小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，LW-AFC對睡眠剝奪小鼠焦 慮樣行為具有改善的趨勢。
1. LW-AFC對束縛應(yīng)激小鼠焦慮樣行為的影響
采用每天束縛小鼠2 h，連續(xù)14 d，建立束縛應(yīng)激模型。結(jié)果表明，與正常對照組相 比，束縛應(yīng)激7 d和14 d后小鼠體重均有降低的趨勢，LW、LW-AFC對小鼠的體重?zé)o明 顯改善作用。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，束縛應(yīng)激7d小鼠自主活動無明顯變化，在曠場中央?yún)^(qū) 停留時間有下降的趨勢；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，進(jìn)入開放臂的次數(shù)和在開放臂內(nèi)停 留時間均顯著減少；LW及LW-AFC具有增加小鼠在曠場中央?yún)^(qū)停留時間、進(jìn)入高架十字 迷宮開放臂的次數(shù)和在開放臂內(nèi)停留時間的趨勢。束縛應(yīng)激14d小鼠自主活動有增加的趨 勢，在曠場中央?yún)^(qū)停留時間無明顯變化；進(jìn)入幵放臂的次數(shù)和在開放臂內(nèi)停留時間均無明 顯變化。上述結(jié)果提示，束縛應(yīng)激7 d可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，而束縛應(yīng)激14 d小鼠 焦慮情緒消失，LW及LW-AFC具有改善束縛應(yīng)激7 d小鼠焦慮樣行為的趨勢。
**章LW-AFC對慢性多重應(yīng)激模型小鼠情緒和認(rèn)知損傷的影響
采用14種應(yīng)激條件隨機(jī)組合，建立慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型，用于模擬**應(yīng)激中多種復(fù)雜未知因素的刺激。選擇氟西汀 (Fluoxetine, FLU)作為陽**，觀察CUMS 14 d和CUMS 28 d對小鼠的情緒和學(xué)習(xí)記憶 功能的改變，評價LW-AFC低劑量（0.8g/kg)、中劑量（1.6g/kg)和高劑量（3.2g/kg)對 其的改善作用，從時效和量效兩個方面考察LW-AFC的藥效。于造模結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)實(shí) 驗(yàn)，評價LW-AFC對CUMS模型小鼠焦慮、抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力損傷的影響。
1. LW-AFC對CUMS模型小鼠體重變化的影響
與正常組小鼠相比，應(yīng)激7、14、21、28 d小鼠體重均顯著降低，FLU、LW及LW-AFC對小鼠體重?zé)o明顯改善作用。
2. LW-AFC對CUMS模型小鼠焦慮樣行為的影響
采用曠場和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠焦慮樣行為。CUMS 14 d后，曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠在曠場中運(yùn)動總距離顯著升高，在曠場中央?yún)^(qū)停留時 間顯著降低；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和在開放臂內(nèi)停 留時間均顯著降低。給予FLU后可顯著增加模型小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)，給予LW可增加 模型小鼠在曠場中央?yún)^(qū)停留時間、進(jìn)入開放臂的次數(shù)和在幵放臂內(nèi)停留時間的趨勢，給予 LW-AFC (3.2g/kg)能夠顯著增加小鼠在開放臂內(nèi)停留時間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)。CUMS 28 d后，模型組小鼠在曠場中運(yùn)動總距離顯著升高，在曠場中央?yún)^(qū)停留時間顯著降低，進(jìn)入 高架十字迷宮開放臂次數(shù)和停留時間均顯著降低。LW-AFC (1.6g/kg)可顯著增加小鼠在 開放臂停留時間，FLU和LW具有增加小鼠在曠場中央?yún)^(qū)停留時間、進(jìn)入開放臂的次數(shù)和 在開放臂內(nèi)停留時間的趨勢。上述結(jié)果提示，CUMS 14 d和28 d均可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生明顯的 焦慮樣行為，FLU、LW和LW-AFC可以改善CUMS 14 d小鼠焦慮樣行為，LW-AFC對 CUMS 14 d和28 d小鼠焦慮樣行為均具有改善作用。
3. LW-AFC對CUMS模型小鼠抑郁樣行為的影響
采用糖水偏愛實(shí)驗(yàn)檢測小鼠抑郁樣行為。結(jié)果表明，與正常組小鼠相比，CUMS 14 d 后，各組小鼠糖水消耗率無明顯變化，提示CUMS 14d未誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。CUMS 28 d后，模型組小鼠糖水消耗率顯著降低，FLU、LW-AFC (3.2g/kg)能顯著增加小鼠糖 水消耗率。上述結(jié)果提示CUMS 28 d可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生明顯的抑郁樣行為，FLU、LW-AFC 均具有改善小鼠抑郁樣行為的作用，且與陽**FLU的作用相當(dāng)，LW具有改善小鼠抑郁 樣行為的趨勢。
2. LW-AFC對CUMS模型小鼠物體識別記憶的影響
采用新物體識別實(shí)驗(yàn)檢測小鼠物體識別記憶能力。結(jié)果表明，CUMS 14 d后，模型組
小鼠于訓(xùn)練期后1 h對新物體的識別指數(shù)無明顯變化，于訓(xùn)練期后24 h對新物體的識別指 數(shù)有降低的趨勢，提示CUMS 14 d對小鼠短時記憶無影響，對小鼠長時記憶有損害的趨勢， FLU、LW及LW-AFC均有改善小鼠長時記憶的趨勢。CUMS28d后，模型組小鼠于訓(xùn)練 期后1 h對新物體的識別指數(shù)無明顯變化，于訓(xùn)練期后24 h對新物體的識別指數(shù)有降低的 趨勢，提示CUMS 28 d對小鼠短時記憶無影響，對CUMS組小鼠長時記憶有損害的趨勢， LW及LW-AFC均有改善小鼠長時記憶的趨勢，而FLU具有損傷小鼠長時記憶的趨勢。
3. LW-AFC對CUMS模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響
采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果表明，與正常組小鼠相比，CUMS 28 d后，模型組小鼠學(xué)習(xí)期逃避潛伏期有延長的趨勢，LW-AFC (3.2g/kg)具有縮短小鼠逃 避潛伏期的趨勢；模型組小鼠測試期逃避潛伏期顯著增加，LW-AFC (3.2g/kg)可顯著降 低小鼠逃避潛伏期；模型組小鼠穿環(huán)次數(shù)有降低的趨勢，FLU、LW及LW-AFC均有增加 小鼠穿環(huán)次數(shù)的趨勢?，模型組小鼠在目標(biāo)象限停留時間顯著降低，FLU、LW-AFC (0.8、 3.2g/kg)可顯著增加小鼠在目標(biāo)象限停留時間。上述結(jié)果提示，CUMS 28d會損傷小鼠的 空間學(xué)習(xí)記憶能力?，FLU、LW-AFC具有改善CUMS模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的作用， LW對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶具有改善的趨勢。
第三章LW-AFC改善慢性應(yīng)激致小鼠情緒和認(rèn)知損傷作用機(jī)制的初步研究
LW-AFC能夠改善慢性多重應(yīng)激小鼠焦慮、抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力損傷，在此基 礎(chǔ)上，本研究從HPA軸功能、神經(jīng)遞質(zhì)及NMDAR-BDNF信號通路等方面探討了 LW-AFC 發(fā)揮抗應(yīng)激藥效的可能作用機(jī)制。
1. LW-AFC對CUMS模型小鼠HPA軸功能的影響
采用放射性免yi法和酶聯(lián)免yi法檢測小鼠血漿CORT、ACTH、下丘腦CRH含量。結(jié) 果表明，與正常組小鼠相比，CUMS 14 d小鼠血漿中CORT含量顯著升高，血漿中ACTH 含量顯著降低，下丘腦釋放的CRH含量顯著降低，FLU、LW及LW-AFC可顯著降低血漿 中CORT含量，LW及LW-AFC( 1.6g/kg)可顯著升高血漿中ACTH含量，LW-AFC(3.2g/kg) 可顯著升高下丘腦釋放的CRH含量。CUMS 28 d模型小鼠血漿中CORT含量顯著升高， 血漿中ACTH含量顯著升高，下丘腦釋放的CRH含量顯著升高，FLU及LW可顯著降低 小鼠血漿中CORT含量，LW及LW-AFC可顯著降低小鼠血漿中ACTH含量。上述結(jié)果提 示，CUMS會導(dǎo)致小鼠HPA軸功能異常，FLU、LW及LW-AFC對CUMS小鼠HPA軸功 能紊亂具有調(diào)節(jié)作用。
