臨床工作中經(jīng)常遇到嬰幼兒患者因病情需要接受多次手術(shù)麻醉，如燒創(chuàng)傷、整形患兒7~10d進(jìn)行一次切痂植皮，或喉乳狀瘤患兒約20d進(jìn)行一次近6h全身麻醉下的手術(shù)，對于此類患兒在大腦發(fā)育期經(jīng)歷多次(≥3次)異氟烷吸入麻醉對其隨后的認(rèn)知功能是否有影響目前尚不明確。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，多次間隔時間較短的異氟烷處理對隨后的空間認(rèn)知功能(八臂迷宮、水迷宮等)有一定影響，但對于非空間記憶如物體識別能力是否有影響，以及如何減弱或避免該影響尚未見報道。目前已知規(guī)律運動對不同年齡段的認(rèn)知均具有促進(jìn)作用，尤其在幼年時期的作用更為顯著，因此，本研究應(yīng)用物體識別行為學(xué)實驗(object recognitiontask，ORT)探索了發(fā)育期多次異氟烷處理后進(jìn)行規(guī)律運動對大鼠成年后非空間認(rèn)知功能中物體識別能力的影響及其性別差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組　生后7d(P7)的SD大鼠110只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證編號：11401300035796。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(Naive)、運動組(Naive+PE)、異氟烷組(Iso)和異氟烷運動組(Iso+PE)。實驗前測量各組大鼠體重，P7、P9和P11時，Naive及Naive+PE組大鼠在上午8:00放置于透明有機玻璃麻醉誘導(dǎo)箱中自由呼吸空氣2h；而Iso及Iso+PE組大鼠則暴露于異氟烷中2h。大鼠P21時，Naive+PE和Iso+PE組大鼠開始規(guī)律運動訓(xùn)練6周，隨即進(jìn)行曠場實驗及**次物體識別測試，運動訓(xùn)練結(jié)束后4周，再次進(jìn)行物體識別實驗，以評價運動后的近期(P67)及遠(yuǎn)期(P95)效果。新生大鼠和母鼠單籠飼養(yǎng)，出生3周后按雌雄分籠。實驗室溫度25±1℃，相對濕度45%~55%，行為學(xué)實驗時用75%乙醇擦拭實驗裝置及物體。實驗方案通過醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置過程中所有操作均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 異氟烷處理　采用實驗動物麻醉機(美國MATRX公司)以3%異氟烷(山東魯南貝特，生產(chǎn)批號64140302)誘導(dǎo)，1.5%異氟烷與30%氧氣混合吸入維持2h。通過檢查幼鼠呼吸頻率及每15min夾尾確保其存活，采用ALC-HTP動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特)維持體溫在36.5±0.5℃，開啟CO2吸附器吸收廢氣。

1. 3 大鼠運動方案　P21 時兩組運動大鼠每天1 4 : 0 0 ~ 1 7 : 0 0 訓(xùn)練， 應(yīng)用XR -PT-10A小動物跑臺( 上海欣軟信息科技有限公司) ， 跑臺是相互間隔的6 條跑道， 每條跑道有效空間為600mm×95mm×115mm，跑臺0°傾角不變，運動強度逐漸加大，幼鼠在跑臺上先適應(yīng)10min，從4m/min開始，每周增加2m/min至14m/min，30min/d，每周5d，持續(xù)6周；運動后統(tǒng)一送回動物房飼養(yǎng)，剔除因受傷等未完成6周訓(xùn)練的大鼠。

1.4 曠場實驗 用于評估動物一般運動能力及探索行為。曠場箱高40cm，長寬均為100cm，動物在安靜黑暗實驗室中適應(yīng)30min，將每只動物放入箱內(nèi)中心位置，并進(jìn)行錄像和計時，任其自由探索5min，分析動物在曠場中央?yún)^(qū)及周圍區(qū)所待時間。

型號：XR-XZ301

1.5 新物體識別實驗 應(yīng)用曠場測試箱，利用嚙齒類動物喜歡接觸和探索新奇事物的天性檢測動物非空間記憶能力。實驗分為三步。① 適應(yīng)階段( hab i t u a t i o nsession)：將大鼠依次放入沒有任何物體的測試箱中，適應(yīng)實驗環(huán)境，連續(xù)3d，共6次。②熟悉階段(sample session)：在距側(cè)壁10cm處放入兩個相同物體——黃色玻璃瓶(F1和F2，高11cm×寬4.8cm)，將大鼠以背對物體方向放入，自由探索5min后將大鼠取出，記錄大鼠物體探索時間。③測試階段(test session)：24h后進(jìn)行測試，將兩個相同物體中F2替換成另一物體N，即熟悉物體(F1)和新奇物體(N)，記錄大鼠5min對兩物體的探索時間。F1和N的位置隨機置換，以避免位置偏倚。探索活動定義為：大鼠鼻子在≤2cm范圍內(nèi)直指向物體或直接接觸物體時的行為，大鼠轉(zhuǎn)頭或坐在物體上時不被認(rèn)為是對物體的探索。P67時**次測試時新奇物體N為紅色塑料瓶(高11cm×寬7cm)；P95時**次測試新奇物體N為金屬鑷筒(高12cm×寬7cm)。

檢測指標(biāo)： 采用動物行為分析系統(tǒng)( SuperMaze動物行為分析軟件) 對曠場及物體識別實驗中各物體的探索時間進(jìn)行分析。物體識別辨別指數(shù)用DR(discrimination ratio)表示。DR=(N–)/(N+F)。

“N”為大鼠對新奇物體的探索時間，“F”為大鼠對熟悉物體的探索時間。DR范圍為[–,1]，

“–”提示大鼠完全偏向于熟悉物體，而“1”則完全偏向于新奇物體。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理　應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況　隨日齡增長，各組大鼠體重增加，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。異氟烷處理后，各組內(nèi)、組間雌/雄幼鼠動脈血氣分析結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。飼養(yǎng)及運動訓(xùn)練過程中剔除受傷或拒絕運動大鼠18只(雄性11只，雌性7只)，*終Naive組雌鼠15只、雄鼠11只，Naive+PE組雌鼠13只、雄鼠10只，Iso組雌鼠10只、雄鼠12只，Iso+PE組雌鼠11只、雄鼠10只。

2.2 曠場實驗結(jié)果　與Naive組相比，各組大鼠在曠場中央?yún)^(qū)及周圍區(qū)探索時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)，提示發(fā)育期多次異氟烷處理及是否規(guī)律運動對大鼠成年后焦慮、探索等自主行為沒有明顯影響。

2.3 發(fā)育期多次異氟烷處理對大鼠成年后物體識能力的影響　與非運動組相比，無論是否經(jīng)過異氟烷處理，運動組(Naive+PE)雄鼠DR均明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(與Naive組及Iso組比較，P67時P=0.050、P=0.017，P95時P=0.037、P=0.019；圖2)；而運動組雌鼠與Naive組相比，P67時DR無明顯差異(P=0.252)；與Iso組相比，P67時運動雌鼠DR顯著下降(P=0.036)，到P95時，與Naive組相比，運動組雌鼠DR明顯增強(P=0.004)，與Iso組相比，運動組雌鼠DR也有增強趨勢(P=0.095)。此外，在P95時，Naive+PE組和Iso組雄鼠的DR及Naive+PE組和Iso+PE組雌鼠的DR均較P67時明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032，P=0.022，P=0.007，P=0.002)。結(jié)果提示運動對雄性大鼠的物體識別能力有明顯促進(jìn)作用，而對雌性大鼠的促進(jìn)作用主要表1 運動對異氟烷處理大鼠成年后曠場實驗結(jié)果的影響別能力的影響　在P67和P95時各組大鼠探索時間比較，組內(nèi)即組建差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。物體識別測試發(fā)現(xiàn)：與Naive組相比，Iso組雌性大鼠在P67時的辨別指數(shù)DR明顯增強(P=0.034)，但到P95時僅出現(xiàn)降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.173)；而Iso組雄性大鼠在P67和P95時DR均有增強趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.341，P=0.052，圖1)。提示發(fā)育期異氟烷處理對于不同性別大鼠成年后物體識別能力的影響存在性別差異，且均無明顯的功能損害。

2.4 運動對多次異氟烷處理大鼠成年后物體識別能力

2.5 運動對異氟烷處理大鼠成年后物體識別能力影響的性別差異　與雄鼠相比，P67時非運動組雌鼠DR明顯較強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Naive組，P=0.022；Iso組，P=0.011)；到P95時，僅沒有經(jīng)過異氟烷處理的兩組雌鼠DR高于雄鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Naive組，P=0.008；Naive+PE組，P=0.017，圖3)。提示雌鼠的物體識別能力明顯優(yōu)于雄性，但運動能夠明顯促進(jìn)雄鼠的物體識別能力的提升。

3 討　　論

臨床及基礎(chǔ)研究顯示， 發(fā)育期接受多次麻醉和手術(shù)是導(dǎo)致學(xué)習(xí)障礙的獨立影響因素，其中麻醉物在大腦發(fā)育期產(chǎn)生的神經(jīng)發(fā)育毒性(anesthesia-induced developmental neurotoxicity，AIDN)對成年后認(rèn)知功能的影響也一直備受關(guān)注，但目前尚未有明確的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，生后發(fā)育期多次異氟烷處理對大鼠成年后非空間認(rèn)知功能中的物體識別能力無明顯損害，并證實運動能夠促進(jìn)大鼠成年后的物體識別能力，且具有明顯的性別差異，雄性大鼠的運動獲益較為明顯，而雌鼠的獲益主要體現(xiàn)在運動后的遠(yuǎn)期效果上。

物體識別實驗是測試大鼠物體識別能力的常用方法，*早由Ennaceur等報道，利用嚙齒類動物喜歡探索新事物的自發(fā)行為進(jìn)行評價。應(yīng)用該方法時實驗動物無須食物誘導(dǎo)，沒有強烈的厭煩因素(如水迷宮中等游泳壓力等)，避免了情緒波動的影響，較為客觀準(zhǔn)確。盡管發(fā)育期異氟烷處理對大鼠成年后在八臂迷宮及水迷宮的空間記憶能力具有一定影響，但在本研究中對大鼠物體識別能力未產(chǎn)生明顯損害，甚至在P67時雌鼠及雄鼠的物體識別能力表現(xiàn)出增強趨勢，但P95時測試發(fā)現(xiàn)對雌鼠對識別能力存在一定的損害趨勢。可能的原因為吸入麻物可通過降低腦代謝、減少氧耗、增加氧供而抑制神經(jīng)元受損，從而起到神經(jīng)保護作用，如有研究顯示麻醉**藥丙泊酚對腦損傷具有一定的保護作用。人類及動物研究均證實，雌性的整體認(rèn)知發(fā)育明顯早于雄性，發(fā)育期異氟烷處理對雌性認(rèn)知功能對損害可能會延續(xù)到遠(yuǎn)期，而雄性仍在發(fā)育階段，給予一定程度的刺激可能促進(jìn)大腦神經(jīng)重塑及修復(fù)等機制，反而促進(jìn)其未來認(rèn)知的發(fā)育，但其具體作用及機制仍需進(jìn)一步研究。運動作為環(huán)境刺激的一部分，對大腦認(rèn)知功能的影響因運動強度與時長不同而不同，如低強度運動明顯促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖，增高神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平，刺激樹突分支形成、突觸發(fā)生等，尤其在大腦發(fā)育階段作用更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是否經(jīng)歷發(fā)育期異氟烷處理，運動均可明顯促進(jìn)雄性大鼠但物體識別能力。該結(jié)果與Hopkins等的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)雄性大鼠經(jīng)過4周自愿運動后物體識別記憶能力明顯提高，且大腦嗅周皮質(zhì)(PER)內(nèi)BDNF水平升高。但對于雌鼠，在運動后1周的測試中，運動組物體識別能力未見明顯提高，直到運動結(jié)束后4周，運動促進(jìn)物體識別能力提高等效果才有所顯現(xiàn)。以往研究也證實，發(fā)育期接受運動對大鼠認(rèn)知功能的影響較成年大鼠能夠持續(xù)更長時間。上述結(jié)果提示發(fā)育期進(jìn)行運動鍛煉能夠?qū)C體產(chǎn)生更為持久的作用。既往的基礎(chǔ)研究多選用雄性動物，以避免雌孕**水平波動而干擾實驗結(jié)果，但認(rèn)知水平的發(fā)展是具有性別差異的，從八臂迷宮測試中可以發(fā)現(xiàn)，雌鼠認(rèn)知行為表現(xiàn)明顯強于雄鼠。雌孕**增強神經(jīng)可塑性，提高大鼠對物體識別能力。相比空間記憶，雌**對物體識別記憶的影響更為明顯。本研究也證實，P67時除Iso+PE組外，其余各組雌鼠的表現(xiàn)明顯優(yōu)于雄性；在P95時，非異氟烷處理的兩組雌鼠物體識別能力依然強于雄鼠。上述研究發(fā)現(xiàn)對于探索雌孕****年齡相關(guān)性記憶減退或其他認(rèn)知障礙性**具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，發(fā)育期多次異氟烷處理及運動對大鼠成年后物體識別能力對影響均具有性別差異，雌鼠的物體識別能力明顯優(yōu)于雄性，但運動對物體識別能力的促進(jìn)作用在雄鼠更為明顯，雌鼠僅體現(xiàn)為遠(yuǎn)期效應(yīng)。本研究對于探討臨床經(jīng)歷多次手術(shù)麻醉的患兒成年后對物體識別能力提供了可參考的實驗證據(jù)，提示運動對于此類患兒具有重要意義，盡管存在性別差異，但運動均可促進(jìn)遠(yuǎn)期物體識別能力的增強，減輕可能存在的AIDN所引起的認(rèn)知損害。但對于雌孕**是否具有確切的促進(jìn)認(rèn)知的作用，仍需進(jìn)一步研究探索。