【摘 要】 目的 探討復(fù)方制劑參益**片改善記憶作用的藥效學(xué)及其作用機(jī)制。方法 采用水迷宮試驗、避暗實驗、跳臺實驗觀察空白對照組、陽性對照組、復(fù)方制劑參益**片高( 1. 607 g/kg) 、中( 0. 536 g/kg) 、低( 0. 269 g/kg) 劑量組對小鼠改善記憶的作用; 采用熒光法對小鼠腦內(nèi) 5-羥色胺( 5-HT) 、多巴胺( DA) 、去甲腎上腺素( NE) 進(jìn)行含量測定，初步研究復(fù)方制劑參益**片改善小鼠記憶的作用機(jī)制。結(jié)果 避暗試驗中劑量組、高劑量組小鼠的潛伏期明顯延長( P＜0. 05) ，錯誤次數(shù)、進(jìn)入暗室的動物數(shù)也明顯減少( P＜0. 05) ; 水迷宮試驗高劑量、中劑量組小鼠 2 min 內(nèi)到終點(diǎn)的動物明顯增加( P＜0. 05) ; 跳臺試驗潛伏期有明顯延長作用( P＜0. 05) ; 腦 5-HT、DA、NE 含量與空白組比較顯著增加。結(jié)論 復(fù)方制劑參益**片具有明顯改善記憶的功能，其機(jī)制可能與 5-HT、DA、NE 的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 參益**片; 學(xué)習(xí)記憶; 5-羥色胺; 多巴胺; 去甲腎上腺素

參益**片是在參芪五味子片的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)報道按照中醫(yī)理論設(shè)計而成的**，由人參、五味子、酸棗仁、益智四種中藥材組成。人參和益智仁為益智**的常用藥，酸棗仁具有養(yǎng)心**、斂汗的功效，它不僅是****不寐之藥，還能滋補(bǔ)強(qiáng)壯，久服能養(yǎng)心健腦; 加用五味子，有酸斂收澀、**生津等功效，善治心腎兩經(jīng)的虛虧或不調(diào)引起的心神不安、驚悸**等。但復(fù)方制劑是否具有明顯的改善記憶、**催眠的作用未見報道。本文主要對復(fù)方制劑參益**片改善記憶作用進(jìn)行藥效學(xué)研究，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實驗藥品及試劑 復(fù)方制劑參益**片，自制。含生藥量 2 g/片( 所需藥材均購于長春市宏檢大藥房) ; 棗東**顆粒( 北京優(yōu)你特藥業(yè)有限公司) 批號: 130501; 實驗所需**均以蒸餾水配制所需濃度。酸性正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛-鹽酸溶液、碘試液、半胱氨酸溶液、p H7. 2 的磷酸鹽緩沖液( PBS) 、乙二胺四乙酸( EDTA) 試液。

1. 2 動物 健康昆明鼠種( KM) ，18 ～ 22 g，雌雄各半，購于吉太小動物用品經(jīng)銷處: 受試小鼠引進(jìn)后置于長春中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室飼養(yǎng)。溫度: ( 20±3) ℃ ，相對濕度: 50% ～ 70% 。

1. 3 實驗儀器 AL 204 萬分之**平( 梅特勒-托利多儀器( 上海) 有限司) ; Cary Eclipse 分子熒光光度計( 鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司) Ｒ205 恒溫水浴鍋( 上海申生科技有限公司) ;T18 basic 組織勻漿儀(廣州儀科實驗室技術(shù)有限 公司) ;KQ3200DB 數(shù)控超聲清洗器( 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司) ;XR-3TB型跳臺實驗儀器(上海欣軟信息科技有限公司) ;XR-XB110小鼠避暗實驗儀器(上海欣軟信息科技有限公司) ; Morris 水迷宮實驗系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) 。

1. 4 方法 將 50 只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組、高劑量組( 1. 606 5 g/kg) 、中劑量組( 0. 535 5 g/kg) 、低劑量組( 0. 267 8 g/kg) ，3 個劑量組分別灌胃給藥參益**片，空白對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予棗東**顆粒，灌胃15 d 后，開始對各組小鼠進(jìn)行訓(xùn)練并測定。

1. 4. 1 跳臺試驗 分別將小鼠放在絕緣平臺上(通過Supersdt軟件實時記錄) 。記錄第 2 次跳下平臺的潛伏期、3 min 內(nèi)的跳下平臺的錯誤次數(shù)和各組跳下臺的動物數(shù)。訓(xùn)練 3 d 后開始測試。

1. 4. 2 避暗實驗 將小鼠置于電擊室，背對洞口，先給予條件刺激( 燈光) 15 s

，在亮燈 10 s 后開始通電 5 s( 電擊強(qiáng)度為0.2mA) 。記錄每只小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期、5 min 內(nèi)進(jìn)入暗室錯誤的次數(shù)和各組進(jìn)入暗室的動物數(shù)。并計算 5 min內(nèi)進(jìn)入暗室( 錯誤反應(yīng)) 的百分率，訓(xùn)練 5 d 后開始測試。

1. 4. 3 水迷宮實驗 從訓(xùn)練第 1 天開始，每批實驗各有 1 只小鼠給藥，平行操作，5 min 后再給**批小鼠注射，以此類推。每天訓(xùn)練 4 次，每次隨機(jī)選擇一個入水點(diǎn)，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間( 潛伏期)

。4 次訓(xùn)練小鼠分別從 4 個不同的入水點(diǎn)入水，如果小鼠在 120 s 內(nèi)未找到平臺，需將其引至平臺。這時潛伏期計為 120 s，每次訓(xùn)練間隔60 s，以 4 次的平均時間及路程作為每天的訓(xùn)練成績，連續(xù)訓(xùn)練5 d后開始測定。

1. 4. 4 復(fù)方制劑參益**片片對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素( NE) 、多巴胺( DA) 、5-羥色胺( 5-HT) 的影響。

1. 4. 4. 1 腦組織 NE 含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，取左半腦組織加入2 ml酸性正丁 醇 后 勻 漿，2 500 r/min 離 心 5 min，分 別 取 上 清 液0. 4 ml，加正庚烷 0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml

超 聲1 min，2 500 r / min 離心 5 min 分別取底層水相。水相 50 μl，加PBS 150 μl加 EDTA 40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置 3 min，分別加醋酸40 μl，混勻，80℃

水浴 10 min，冷卻即得。吸取各樣品 200 μl 置96 孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測定，激發(fā)波長 382 /488。

1. 4. 4. 2 腦組織中 DA 的含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 勻 漿，分 別 取 上 清 液 0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超聲 1 min，2 500 r / min 離心5 min分別取底層水相。水相 50 μl，加 PBS 150 μl 加 EDTA40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混勻，靜置 3 min，分別加堿性磷酸鈉

40 μl，混勻，靜置 3 min，分別加 5 mol/L 醋酸 40 μl，混勻，100℃ 水浴15 min，冷卻即得。精密吸取各樣品 200 μl 置 96 孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測定，激發(fā)波長為 325 /385。記錄結(jié)果。

1. 4. 4. 3 腦組織中 5-HT 的含量測定 上述實驗小鼠 50 只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 勻 漿，分 別 取 上 清 液0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超聲 1 min，2 500 r / min 離心 5 min 分別取底層水相。取水相 0. 4 ml，加入 0. 25% 半胱氨酸( 新配) 0. 1 ml，再加入 0. 002% OPT-10 NHCl 3 ml?；靹颍兴?0 min，冷卻即得。精密吸取各樣品 200 μl 置 96 孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測定，激發(fā)波長為 368 /480。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行 t 檢驗。

2 結(jié) 果

2. 1 復(fù)方制劑參益**片跳臺實驗結(jié)果 陽性對照組、中劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較顯著差異( P＜0. 05或 P＜0. 01) ，高劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異( P＜0. 01) 。

2. 2 復(fù)方制劑參益**片避暗實驗結(jié)果 中劑量組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有顯著差異( P＜0. 05) ，高劑量組、陽性對照組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異( P＜0. 01) ，其他4 組測試潛伏期與空白對照組比較均有增長。

2. 3 復(fù)方制劑參益**片水迷宮實驗結(jié)果 中劑量組、高劑量組實驗完成時間〔( 69. 84±23. 37) s、( 65. 45±22. 98) s〕與空白對照組〔( 114. 82±7.96) s〕比較差異顯著( P＜0. 05) 。陽性對照組為( 101. 72±26. 32) s，低劑量組為( 80. 50±27. 65) s。

2. 4 小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定結(jié)果 高、中劑量組腦內(nèi) 5-HT、DA、NE 含量與空白對照組比較顯著增加( P ＜0. 05) ，低劑量組與空白對照組比較均升高，但無顯著差異( P ＞0. 05) 。

3 討 論

參益**片選取了四味常用的中藥進(jìn)行配伍，通過避暗試驗、跳臺試驗、水迷宮試驗可以看出無論是錯誤次數(shù)還是潛伏期給藥組都有所改善，其藥效與陽性對照藥對比藥效相當(dāng)，因而從藥效學(xué)角度看來，參益**片的改善學(xué)習(xí)記憶作用可以得到較充分的肯定，有較好的益智作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶胺和吲哚胺兩類，前者包括 DA、NE 和腎上腺素，后者為 5-HT，大腦皮質(zhì)、紋狀體中存在大量的DA 和 5-HT 能神經(jīng)末梢，他們對**活動如感情、學(xué)習(xí)、記憶起重要作用

。DA 含量下降是腦功能衰老的表現(xiàn)之一，學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)常伴有 NE、DA 的增加但對 5-HT 的報道還不是特別明確。參益**片片改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與 5-HT、DA、NE的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)報道，神經(jīng)**內(nèi)的 DA 代謝會影響 NE

的代謝，NE 可能調(diào)節(jié)廣泛腦區(qū)的突觸傳入活動，增大環(huán)境中有意義的信息傳入，而抑制其他傳入刺激的干擾，從而提高注意力，增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力。

本實驗采用熒光法對神經(jīng)遞質(zhì)的含量進(jìn)行測定用于研究改善記憶的作用機(jī)制，熒光法與液相色譜法進(jìn)行比較，熒光法實驗?zāi)芴岣邔嶒炐?，目前試劑盒的?yīng)用也越來越廣泛，可以在后續(xù)的機(jī)制研究試驗中進(jìn)行優(yōu)選。