摘要目的: 觀察穿梭實(shí)驗(yàn)對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及腦組織血管緊張素含量的影響, 并與甲磺酸雙氫麥角毒堿作用效果進(jìn)行比較。

方法: 實(shí)驗(yàn)于 2005- 07 /11 在解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所七室完成。①選用清潔級(jí) 15～18 月齡 Wistar 大鼠 48 只, 雌雄不拘,體質(zhì)量( 200±20) g。按隨機(jī)摸球法將 48 只大鼠分為 4 組: 假手術(shù)組、模型組、中藥組和西藥組(陽(yáng)性對(duì)照組), 每組 12 只。除假手術(shù)組外( 進(jìn)行假手術(shù)) , 其余組大鼠均采用改良 Pulsinellis 四血管阻斷法建立血管性癡呆模型。中藥組:以 0.45 g/( kg·d) 劑量灌胃步長(zhǎng)腦心通混懸液, 由咸陽(yáng)步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn),由黃芪、乳香、沒(méi)藥、全蝎、地龍等 16 味中藥組成, 0.4 g/粒; 西藥組: 以 0.32 mg/( kg·d) 劑量灌胃甲磺酸雙氫麥角毒堿混懸液, 該藥由瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產(chǎn), 生產(chǎn)批號(hào): 970141, 1 mg/片; 假手術(shù)組和模型組灌胃同容量生理鹽水; 每天分早、中、晚 3 次。術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始用藥, 連續(xù)8 周。②于造模前, 造模后 2,4, 8 周進(jìn)行穿梭箱檢查, 以主動(dòng)回避反應(yīng)比率表示大鼠的認(rèn)知能力。于給藥結(jié)束后采用放射**分析法測(cè)定大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦、海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量。③對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差、均數(shù)間多重比較 q 檢驗(yàn); 數(shù)據(jù)間相關(guān)性處理采用直線相關(guān)分析。

結(jié)果: 造模過(guò)程中如有動(dòng)物死亡則補(bǔ)充相應(yīng)只數(shù), *終進(jìn)入結(jié)果分析的大鼠保持為 48 只。①主動(dòng)回避反應(yīng)比率: 模型組和中、西藥組大鼠術(shù)后2, 4, 8 周明顯低于假手術(shù)組(P < 0.01); 2 個(gè)**組均明顯高于模型組 (P< 0.01); 

兩**組間比較, 差異不明顯(P > 0.05)。②血管緊張素Ⅱ含量:模型組大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬明顯高于假手術(shù)組(P < 0.01), 中、西藥組明顯低于模型組( P < 0.01) , 兩**組間差異不明顯 (P > 0.05)。③精氨酸加壓素含量: 模型組大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬明顯低于假手 術(shù) 組 ( P < 0.01) ; 中 、西 藥 組 明 顯 高 于 模 型 組 ( P < 0.01) ; 中 藥 組大腦皮質(zhì)、下丘腦明顯高于西藥組( P < 0.05) , 在海馬與西藥組相近( P > 0.05) 。④相關(guān)性分析結(jié)果: 假手術(shù)組、模型組、中藥組和西藥組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ含量與主動(dòng)回避反應(yīng)比率呈負(fù)相關(guān)(r=- 0.894, - 0.872,- 0.928, - 0.880, P < 0.05) , 而上述各組大鼠海馬精氨酸加壓素含量與主動(dòng)回避反應(yīng)比率呈顯著正相關(guān)( r=0.912, 0.892, 0.937, 0.897, P < 0.05) 。

結(jié)論: 步長(zhǎng)腦心通改善血管性癡呆模型大鼠認(rèn)知功能的作用可能是通過(guò)降低海馬等腦組織血管緊張素Ⅱ含量、提高精氨酸加壓素含量而實(shí)現(xiàn), 作用效果與甲磺酸雙氫麥角毒堿相當(dāng)。

主題詞: 癡呆, 血管性 /中藥療法; 血管緊張素Ⅱ; 精氨酸升壓素; 認(rèn)知障礙; 認(rèn)知

引言

步長(zhǎng)腦心通是以《內(nèi)經(jīng)》“五臟藏神”理論為指導(dǎo),具有****、化瘀通絡(luò)、醒腦開(kāi)竅、宣痹止痛之功效的中成藥。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察步長(zhǎng)腦心通對(duì)血管性癡呆模型大鼠認(rèn)知功能及大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量的影響, 為血管性癡呆尋求有效**手段, 探索中藥**血管性癡呆的確切藥理機(jī)制。

1 

材料和方法

設(shè)計(jì): 完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)。

單位: 解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)內(nèi)科。

材料: 實(shí)驗(yàn)于 2005- 07 /11 在解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所七室( 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) 完成。選用清潔級(jí)老齡( 15～18 月齡) Wistar 大鼠 48 只,雌雄不拘, 體質(zhì)量( 200±20) g, 由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 ( 許可證號(hào): SCXK( 渝) 2003- 0003) 。按隨機(jī)摸球法將 48 只大鼠分為 4組: 假手術(shù)組、模型組、中藥組和陽(yáng)性對(duì)照組, 每組 12 只。每籠 6 只, 大鼠自由覓食喝水, 在室溫(22±1) ℃、濕度

( 50±5) %環(huán)境下喂養(yǎng)。

**和試劑: 步長(zhǎng)腦心通膠囊( 咸陽(yáng)步長(zhǎng)制藥有限公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20025001, 0.4 g/粒) , 由黃芪、乳香、沒(méi)藥、全蝎、地龍等 16 味中藥組成。以生理鹽水制成混懸液。喜得鎮(zhèn)( 瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產(chǎn), 批準(zhǔn)文號(hào): (91)衛(wèi)藥準(zhǔn)字 X- 156 號(hào), 1 mg/片, 生產(chǎn)批號(hào): 970141) , 

用生理鹽水配成混懸液。血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素放射**分析法藥盒分別購(gòu)自中國(guó)同位素公司北方試劑研究所和解放軍**軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室。

設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者: 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為**作者, 干預(yù)實(shí)施為全部作者, 主動(dòng)回避反應(yīng)和腦組織血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量檢測(cè)為另二工作人員, 檢測(cè)者不知曉動(dòng)物分組情況, 均受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)。

方法:

改良 Pulsinellis 四血管阻斷法制作血管性癡呆模型: 除假手術(shù)組外, 其余大鼠用 10 g/L 的****鈉腹腔注射麻醉, 大鼠取頸前部正中切口, 鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈, 穿 4 號(hào)線備用, 縫合頸部皮膚。然后取頸背部正中切口, 沿**頸椎翼小孔燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈,阻斷血供 24 h 后, 再以微動(dòng)脈夾反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈, 5 min /次, 間隔 1 h, 共 3 次。假手術(shù)組除不燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈, 不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外, 其余處理同前。

給**法: 中藥組: 參照文獻(xiàn)以 0.45 g/( kg·d)劑量灌胃步長(zhǎng)腦心通混懸液; 西藥組: 以 0.32 mg/(kg·d)劑量灌胃甲磺酸雙氫麥角毒堿混懸液; 假手術(shù)組和模型組灌胃同容量生理鹽水; 分早、中、晚 3 次。術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始用藥, 連續(xù)8 周。

穿梭箱檢查: 采用上海欣軟信息科技有限公司提供的穿梭箱主動(dòng)回避反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)以聲、光為條件刺激。如大鼠在條件刺激后即能完成穿梭動(dòng)作稱主動(dòng)回避反應(yīng)。大鼠的認(rèn)知功能以完成主動(dòng)回避反應(yīng)的次數(shù)與測(cè)試總次數(shù)(20 

次)的比值即主動(dòng)回避反應(yīng)比率表示。術(shù)前大鼠行 7 d 的穿梭箱訓(xùn)練, 以主動(dòng)回避反應(yīng)比率≥ 80%入選, < 80%

者淘汰;于術(shù)前, 術(shù)后 2, 4, 8 周行穿梭箱檢查。

標(biāo)本采集、處理及儲(chǔ)存: 大鼠于給藥結(jié)束后在無(wú)麻醉下快速斷頭、取全腦, 置沸生理鹽水中煮 5 min 取出, 用濾紙吸干附著的液體后, 分離大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬, 分別稱重后加入 1 mol /L HCl 1 m L, 勻漿后倒入塑料指形管中, 室溫放置 100 min, 再加入 1 mol /LNa OH 1 m L, 4 

℃, 4 000 r /min, 離心 10 min, 取上清液, 置- 70 ℃ 冰箱保存待測(cè)。

指標(biāo)測(cè)定: 采用放射**分析法 測(cè)定血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量。操作嚴(yán)格按藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)本實(shí)際濃度。

主要觀察指標(biāo): ①造模前后各組大鼠主動(dòng)回避反應(yīng)比率差異。②給藥結(jié)束后各組大鼠不同腦區(qū)血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量比較。③給藥結(jié)束后各組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量與主動(dòng)回避反應(yīng)的相關(guān)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 計(jì)量結(jié)果采用 x±s 表示; 由**作者采用 SPSS 10.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差、均數(shù)間多重比較q 檢驗(yàn); 數(shù)據(jù)間相關(guān)性處理采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 納入大鼠 48 只, 造模過(guò)程中如有動(dòng)物死亡則補(bǔ)充相應(yīng)只數(shù), *終進(jìn)入結(jié)果分析的大鼠保持為 48 只。

2.2 各組大鼠穿梭箱檢查結(jié)果 見(jiàn)表 1。

2.3 給藥結(jié)束后各組大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ含量比較 見(jiàn)表 2。

2.4 給藥結(jié)束后各組大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬精氨酸加壓素含量比較 見(jiàn)表 3。 

2.5 各組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量與主動(dòng)回避反應(yīng)的相關(guān)性分析 假手術(shù)組、模型組、中藥組和西藥組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ含量與主動(dòng)回避反應(yīng)比率呈負(fù)相關(guān)( r=- 0.894, - 0.872, - 0.928,- 0.880, P < 0.05) , 而各組精氨酸加壓素含量與主動(dòng)回避 反 應(yīng) 比 率 呈 顯 著 正 相 關(guān) ( r =0.912, 0.892, 0.937,

0.897, P < 0.05) 。

3 討論

血管性癡呆是由于反復(fù)腦缺血導(dǎo)致與認(rèn)知活動(dòng)相關(guān)的海馬、皮質(zhì)等結(jié)構(gòu)不可逆的損害。從中醫(yī)辨證的角度來(lái)看, 系腎精虧虛、髓海失充、肝郁脾虛、痰阻血瘀、心脾虧損, 復(fù)因情志失調(diào)、勞作失度, 或他病累及而引發(fā)肝風(fēng), 風(fēng)挾痰瘀, 血苑于上, 發(fā)為本病; 其中腎虛血瘀是關(guān)鍵。步長(zhǎng)腦心通由黃芪、乳香、沒(méi)藥、全蝎、地龍等16 味中藥組成, 立法方義就是****、化瘀通絡(luò), 且能扶正固本、攻補(bǔ)兼施、標(biāo)本同治, 使瘀散血**暢, 心腦脈絡(luò)得以濡養(yǎng), 可列為**血管性癡呆優(yōu)選中成藥。

本實(shí)驗(yàn)采用電腦控制的穿梭箱系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)模型組大鼠造模后 2, 4, 8 周主動(dòng)回避反應(yīng)比率均明顯低于假手術(shù)組(P < 0.01); 中、西藥組雖明顯低于假手術(shù)組 P < 0.01), 但均明顯高于模型組(P < 0.01); 

兩**組間則無(wú)明顯差異(P > 0.05)。表明慢性腦灌注不足可引起大鼠認(rèn)知功能損害, 而步長(zhǎng)腦心通與西藥甲磺酸雙氫麥角毒堿療效相當(dāng), 對(duì)腦組織細(xì)胞起到修復(fù)營(yíng)養(yǎng)作用, 并顯著改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能。

血管緊張素Ⅱ和精氨酸加壓素是具有生物活性的多肽, 不僅在血液中起著類似循環(huán)**的作用, 而且在**神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著神經(jīng)遞質(zhì)的作用, 參與腦的**神經(jīng)功能, 與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。海馬及其周圍皮質(zhì)是外顯記憶神經(jīng)通路的重要組成部分。因此,在探討血管性癡呆發(fā)病機(jī)制、干預(yù)**、**篩選及評(píng)價(jià)中檢測(cè)不同腦區(qū)血管緊張素Ⅱ和精氨酸加壓素的含量變化, 近年來(lái)日益受到人們的關(guān)注。

除腎素- 血管緊張素系統(tǒng)外, 腦內(nèi)存在局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)。血管緊張素Ⅱ是腦內(nèi)腎素- 血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)物質(zhì), 在下丘腦含量*高, 大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)含量也相當(dāng)豐富。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是學(xué)習(xí)、記憶儲(chǔ)存的功能單位, 在海馬齒狀回 CA1 到 CA3 區(qū)均有習(xí)得性長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的突觸應(yīng)。Wayner 等發(fā)現(xiàn)將血管緊張素Ⅱ直接注入海馬背側(cè), 可抑制長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的產(chǎn)生; 如提前注入選擇性血管緊張素受體亞型 1的拮抗劑, 則可阻斷此反應(yīng)。近年來(lái)又證實(shí)腦室注入血管緊張素Ⅳ或其受體激動(dòng)劑可易化長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng), 顯著改善大鼠記憶的獲取、保留和再現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 模型組大鼠大腦皮質(zhì)、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ含量顯著高于假手術(shù)組(P < 0.01), 中、西藥組較模型組則有明顯下調(diào)趨勢(shì)( P < 0.01) 。揭示在血管性癡呆的發(fā)病中, 腦缺血、缺氧可能干擾了**腎素- 血管緊張素系統(tǒng), 引起某些核團(tuán)神經(jīng)元及其交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng), 導(dǎo)致腦內(nèi)血管緊張素Ⅱ含量持續(xù)顯著升高,進(jìn)而影響了認(rèn)知功能; 同時(shí)表明步長(zhǎng)腦心通與西藥組一樣可通過(guò)改善腦血液循環(huán)、保護(hù)腦組織, 使受損的神經(jīng)元得以修復(fù), 從而調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ的分解、合成與釋放, 對(duì)血管性癡呆有顯著的改善作用。

大腦的邊緣系統(tǒng)尤其是海馬在信息整合、儲(chǔ)存和傳導(dǎo)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用, 對(duì)維持機(jī)體正常的學(xué)習(xí)記憶是不可缺少的。近年研究發(fā)現(xiàn)海馬 CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與丟失是血管性癡呆形成的病理學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中, 慢性腦缺血、中西藥**使腦組織不同區(qū)域血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量明顯降低或增多, 大鼠主動(dòng)回避反應(yīng)比率也出現(xiàn)相應(yīng)顯著性改變, 其中海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化與主動(dòng)回避反應(yīng)比率尤 為 密 切 , 呈 顯 著 直 線 ( 正 或 負(fù) ) 相 關(guān) ; 揭示海馬的這些神經(jīng)肽代謝對(duì)維持或改善學(xué)習(xí)記憶功能更為關(guān)鍵, 充分體現(xiàn)海馬在學(xué)習(xí)記憶功能方面的重要生物學(xué)意義。總之, 步長(zhǎng)腦心通**血管性癡呆的機(jī)制可能是通過(guò)降低海馬等腦組織血管緊張素Ⅱ含量、提高精氨酸加壓素含量而實(shí)現(xiàn), 但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。