【摘要】目的 探討minocycline抑制炎癥反應(yīng)對血管性抑郁小鼠行為及神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法 成年雄性CD1小鼠隨機分為3組，每組各10只，實驗組造模后立即腹腔注minocycline每日1次連續(xù)7 d（30 mg/kg），對照組造模后給予同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組除不阻斷頸動脈供血外，其余手術(shù)操作與實驗組相同，術(shù)后同樣給予腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。術(shù)后第8天起行懸尾實驗（第8天）、曠場實驗（第9天）檢測抑郁行為，水迷宮定向航行實驗（第10天）檢測認知能力。術(shù)后第11天處死取腦，分離海馬勻漿，酶聯(lián)**吸附測定（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量，并通過高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）對抑郁相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進行檢測，包括5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）及多巴胺（dopamine，DA）。結(jié)果 3組小鼠懸尾實驗不動時間差異有顯著性［實驗組：（174.75±11.37）s，對照組：（194.32±14.32）s，假手術(shù)組：（169.62±19.27）s，F(xiàn)=6.59，P=0.005］；與對照組相比，實驗組和假手術(shù)組懸尾不動時間顯著縮短；3組小鼠探洞次數(shù)、活動時間、活動路程差異顯著（F=6.17，P=0.008；F=11.55，P＜0.001；F=13.47，P＜0.001）；與對照組相比，實驗組與假手術(shù)組探洞次數(shù)明顯增多［實驗組：（50.86±9.23）次，對照組：（35.73±11.96）次，假手術(shù)組：（48.14±10.16）次］，活動時間與活動總路程均明顯延長［實驗組：（786.70±27.51）s，對照組：（738.88±36.00）s，假手術(shù)組：（807.90±33.16）s；實驗組：（37 171.42±8493.40）mm，對照組：（28 992.91±5760.03）mm，假手術(shù)組：（47 206.23±8219.84）mm］；水迷宮實驗潛伏期差異有顯著性［實驗組：（87.38±13.36）s，對照組：（88.50±19.88）s，假手術(shù)組：（44.38±19.76）s，F(xiàn)=16.09，P＜0.001］，與假手術(shù)組相比，實驗組和對照組潛伏期顯著延長。炎癥因子檢測提示，3組海馬TNF-α、IL-1β及IL-6差異具有顯著性［實驗組：（141.10±24.36）pg/100 mg，對照組：（167.6±15.91）pg/100 mg，假手術(shù)組：（123.8±15.53）pg/100 mg，F(xiàn)=13.42，P＜0.001；實驗組：（5.32±1.89）pg/mg，對照組：（10.31±2.83）pg/mg，假手術(shù)組：（4.50±2.07）pg/mg，F(xiàn)=18.69，P＜0.001；實驗組：（20.01±3.62）pg/mg，對照組：（24.39±5.04）pg/mg，假手術(shù)組：（18.40±3.78）pg/mg，F(xiàn)=5.49，P=0.010］；與對照組相比，實驗組與假手術(shù)組3種炎性細胞因子均顯著降低。3組海馬5-HT及DA含量差異有顯著［實驗組：（3.89±1.21）ng/ml，對照組：（3.13±1.44）ng/ml，假手術(shù)組：（5.01±1.68）ng/ml，F(xiàn)=4.17，P=0.026；實驗組：（10.72±2.65）ng/ml，對照組：（7.99±2.31）ng/ml，假手術(shù)組：（11.76±3.10）ng/ml，F(xiàn)=5.18，P=0.012］；與對照組相比，實驗組和假手術(shù)組DA含量顯著增加，實驗組5-HT含量差異無顯著性，而假手術(shù)組5-HT含量增多；3組NE含量差異無顯著性［實驗組：（3.97±1.35）ng/ml，對照組：（3.16±1.55）ng/ml，假手術(shù)組：（4.68±1.99）ng/ml，F(xiàn)=2.13，P=0.139］。結(jié)論 Minocycline能夠抑制血管性抑郁小鼠炎癥因子的表達，**癥**可改善其抑郁行為，對認知損害未觀察到明顯改善，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)以DA的改變?yōu)?明顯。

【關(guān)鍵詞】 血管性抑郁；炎癥因子；神經(jīng)遞質(zhì)；****

血管性抑郁（vascular depression）是老年遲發(fā)性抑郁的一個主要類型，與腦血管**及其危險因素密切相關(guān)，常伴有以執(zhí)行功能障礙為主的認知功能障礙，屬難治性抑郁，且易發(fā)展為血管性癡呆（vascular dementia，VaD）。但血管性抑郁的發(fā)病機制至今不明。炎癥假說認為，促炎性細胞因子可通過影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝通路導(dǎo)致5-羥色胺的減少以及色氨酸毒性代謝產(chǎn)物的增加，進而促使海馬神經(jīng)元壞死和凋亡，導(dǎo)致了抑郁癥狀和認知功能障礙的發(fā)生。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)在反復(fù)缺血再灌注法制備的血管性抑郁動物模型中，**炎癥細胞——小膠質(zhì)細胞活化增生，炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65/p50表達增加，提示炎癥與血管性抑郁可能存在一定的關(guān)系。

但是常規(guī)抗抑郁**如5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake

inhibitor，SSRI）或5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑（serotonin-norepinephrinereuptake inhibitor，SNRI）通過增加突觸間隙5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）改善抑郁，但對血管性抑郁療效欠佳。研究發(fā)現(xiàn)，過高的炎性細胞因子可影響腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（如5-HT）的合成和再攝取，進而導(dǎo)致抑郁，提示血管性抑郁中炎癥反應(yīng)所伴的炎性細胞因子表達增高可能也參與影響了相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝及結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致常規(guī)抗抑郁**療效不佳，且容易出現(xiàn)認知損害。

因此，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過外源性****minocycline抑制多種促炎性細胞因子表達，觀察血管性抑郁小鼠行為及神經(jīng)遞質(zhì)代謝的變化，初步探討炎癥抑制在血管性抑郁**中的作用，為臨床對血管性抑郁患者的**提供實驗依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗動物分組及模型構(gòu)建 CD1雄性小鼠30只，周齡10周，體重25～30 g（訂購于**軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，SPF級），隨機分為實驗組、對照組和假手術(shù)組，每組10只，造模前常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周。

應(yīng)用前期實驗中采用的反復(fù)缺血再灌注法進行制備血管性抑郁小鼠模型。步驟如下：小鼠經(jīng)腹腔注射0.3%****麻醉成功后，取仰臥位，門齒及四肢固定，剪開頸前皮膚及筋膜，在氣管兩側(cè)分別分離出左右頸動脈，使用小號動脈夾阻斷雙側(cè)頸動脈供血5 min后，松開動脈夾恢復(fù)供血10 min，再次阻斷供血5 min后移除動脈夾，術(shù)中密切觀察小鼠呼吸、心跳，術(shù)畢縫合皮膚，立即腹腔注射minocycline（30 mg/kg），對照組給予腹腔注射等劑量生理鹽水，恒溫板上復(fù)蘇，清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不阻斷頸動脈供血外，其余手術(shù)操作與實驗組相同。小鼠手術(shù)當(dāng)日定為術(shù)后第1天，術(shù)后第1～7天依照不同分組連續(xù)注射minocycline及生理鹽水每日一次，給藥完成后于術(shù)后第8天開始行為學(xué)檢測。前期工作已發(fā)表模型組與假手術(shù)組行為學(xué)檢測的結(jié)果，在懸尾實驗、暗箱實驗等抑郁行為檢測中發(fā)現(xiàn)，模型組動物較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的抑郁行為，確定動物模型成功。

1.2 行為學(xué)檢測 抑郁行為學(xué)檢測包括懸尾實驗（tail suspension test，TST）、探洞曠場試驗（open-field test）、認知功能檢測為Morris水迷宮檢測。造模術(shù)后第8天開始行為學(xué)測試。

TST檢測動物的抑郁行為，基于Steru等之前建立的方法稍加改進，采用上海欣軟信息科技有限公司的SuperTst小鼠懸尾系統(tǒng)，安排在術(shù)后第8天18∶00～22∶00進行，距尾尖約1 cm處用膠布固定于懸尾系統(tǒng)測試箱的尾鉤上，小鼠頭部距地面約7.5 cm，關(guān)閉測試箱開始計時，共觀察6 min，適應(yīng)2 min，設(shè)定軟件記錄后4 min的小鼠不動時間。與假手術(shù)組的小鼠不動時間相比較，當(dāng)實驗組或?qū)φ战M小鼠不動時間顯著延長，可判定為小鼠出現(xiàn)抑郁行為。

探洞曠場試驗檢測動物的抑郁行為，根據(jù)文獻中介紹的通用的小鼠分析方法。采用

上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)于術(shù)后第9天進行，將小鼠依次放入曠場測試箱（25 cm×25 cm×38 cm）中，測試箱底部有16個圓形小洞，放入小鼠后2 min開始記錄，測試時間15 min，記錄探洞次數(shù)、活動時間與總路程。當(dāng)實驗組或?qū)φ战M小鼠較假手術(shù)組小鼠探洞次數(shù)減少、活動時間縮短或總路程減少且差異有顯著性時，可判定為該組小鼠出現(xiàn)抑郁行為。

Morris水迷宮檢測動物的認知行為，按照文獻中對小鼠空間認知檢測的方法進行定位航行實驗。實驗采用上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)水迷宮裝置，水池直徑120 cm，高50 cm，維持水溫21～22℃，第三象限放置平臺，平臺置于水面下1 cm，術(shù)后第10天開始測試（第9天進行訓(xùn)練，每只小鼠訓(xùn)練4次，每次120 s），隨機選擇4個象限作為入水點，將動物面向池壁放入水中，同時開始記錄小鼠入池至尋找并爬上平臺所需時間，即潛伏期（latency），使其在平臺上停留20 s后取走，如小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺則將其引導(dǎo)上臺并停留20 s，記錄潛伏期為120 s，計算每只小鼠的平均潛伏期。

1.3 海馬組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6含量測定 小鼠術(shù)后第11天處死，磷酸鈉鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）灌注，剝離腦組織，冰上操作分離海馬，稱重后加入150 μl生理鹽水勻漿，采用酶聯(lián)**吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測盒（上海酶聯(lián)生物科技公司提供），根據(jù)操作說明進行測定腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量，檢測范圍*低值分別為1.4 pg/mg、9.1 pg/mg及0.2 pg/mg。

1.4 5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量測定方法與標準曲線 采用美國安捷倫公司高效液相色譜儀Agilent 1100 Series HPLC，包括在線脫氣機、四元泵、高性能自動進樣器、柱溫箱、熒光檢測器，色譜柱采用AgilentZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×150 mm

5 μm）；流動相：0.1 mol NaAc+0.01 mol乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（醋酸調(diào)節(jié)血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

pH=5.1）：甲醇（V/V）=93∶7；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；熒光增益值：10；激發(fā)波長：290 nm；發(fā)射波長：330 nm。精密稱取3種神經(jīng)遞質(zhì)標準品至10 ml量瓶中，用2%的HClO4生理鹽水溶解制得標準溶液。對3種標準溶液依次稀釋，制得濃度為2.0 μg/ml、1.0μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml和0.04 μg/ml的標準系列溶液，取標準系列溶液20 μl進樣分析，以各成分的濃度（C，μg/ml）對3種待測物峰面積（Y），用*小二乘法進行線性回歸分析，得標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)。

1.5 海馬組織中5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺的含量測定 精密稱取小鼠海馬組織于血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

1.5 ml的EP管中，加入150 μl生理鹽水勻漿，加入100 μl的4%HClO4溶液，于14 000 rpm下低溫離心 20 min，取上清液進樣分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（ s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組之間的比較采用SNK檢驗，P＜0.05被認為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 minocycline對血管性抑郁小鼠抑郁行為及認知能力的影響 懸尾實驗中，實驗組、對照組及假手術(shù)組的小鼠懸尾不動時間差異具有顯著性（F=6.59，P=0.005）（表2），SNK檢驗顯示，與對照組相比，實驗組和假手術(shù)組懸尾不動時間縮短，差異有顯著性，實驗組小鼠懸尾不動時間長于假手術(shù)組，但兩組差異無顯著性；探洞曠場實驗中，實驗組、對照組及假手術(shù)組的小鼠探洞次數(shù)、活動時間、活動路程差異具有顯著性（F=6.17，P=0.008；F=11.55，P＜0.001；F=13.47，P＜0.001），SNK檢驗顯示，與對照組相比，實驗組和假手術(shù)組探洞次數(shù)、活動時間、活動路程均增多，且差異有顯著性，實驗組較假手術(shù)組的探洞次數(shù)增多、活動時間減少，但兩組間差異無顯著性，實驗組較假手術(shù)組小鼠活動路程減少，且差異有顯著性。Morris水迷宮實驗中，3組小鼠的潛伏期差異有顯著性（F=16.09，P＜0.001），SNK檢驗顯示，與假手術(shù)組相比，實驗組和對照組潛伏期延長，但兩組間相比潛伏期差異無顯著性。結(jié)果表明，經(jīng)給予minocycline**處理后，血管性抑郁小鼠的抑郁行為可得到改善，但其認知能力卻無明顯改善。

2.2 minocycline對小鼠海馬組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6含量的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，實驗組、對照組及假手術(shù)組小鼠海馬組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量差異均有顯著性（F=13.42，P＜0.001；F=18.69，P＜0.001；F=5.49，P=0.010），SNK檢驗顯示，與對照組相比，實驗組和假手術(shù)組3種促炎性細胞因子均降低，差異有顯著性，實驗組小鼠海馬炎癥因子含量稍高于假手術(shù)組，但兩組差異無顯著性。結(jié)果顯示，minocycline對血管性抑郁小鼠海馬組織中3種促炎性細胞因子的表達均有抑制作用。血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

2.3 minocycline對小鼠海馬組織5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量的影響 通過對前處理方法的優(yōu)化，*終選擇2%的HClO4生理鹽水溶解，以保證3種神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性，在此色譜條件下，3種神經(jīng)遞質(zhì)的色譜峰完全分離，保留時間分別為1.35 min，2.65 min，4.56 min，典型的色譜圖如圖2所示。其標準曲線方程如表1所示，從結(jié)果看出3種化合物在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.9990。海馬組織勻漿中3種神經(jīng)遞質(zhì)含量測定結(jié)果顯示，3組樣本中5-HT、DA的含量差異具有顯著性（F=4.17，P=0.026；F=5.18，P=0.012），NE的含量差異無顯著性（F=2.13，P=0.139）（圖3）。SNK檢驗顯示，與實驗組相比，對照組和假手術(shù)組5-HT含量差異無顯著性，但假手術(shù)組5-HT含量高于對照組；與對照組相比，實驗組與假手術(shù)組DA含量增高，差異具有顯著性，但兩組間DA的含量差異無顯著性。結(jié)果表明，minocycline對血管性抑郁模型小鼠海馬中5-HT和NE無明顯影響，但DA含量增加.

3 討論

1997年Alexopoulos**提出“血管性抑郁”的概念，但腦血管**導(dǎo)致抑郁發(fā)生的機制不明。Alexopoulos分析了一系列臨床研究后于2011年提出了血管性抑郁發(fā)病機制的“炎癥反應(yīng)假說”，認為年齡及腦血管病相關(guān)的炎癥過程介導(dǎo)了抑郁癥狀的發(fā)生。

薈萃分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的SSRI類抗抑郁**可降低血清中TNF、IL-1β、IL-6水平，TNF-α拮抗劑依那西普和非甾體**藥塞來昔布對重癥抑郁患者的癥狀改善具有一定的**效果，但機制仍不明確。盡管****抑郁的研究取得一定進展，但針對血管性抑郁的**干預(yù)研究仍然較少。

**代半合成四環(huán)素類**minocycline可快速通過血腦屏障，抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，其**作用主要通過直接和間接地抑制**神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞的激活和增殖，進而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的釋放表達。而前述的炎癥反應(yīng)抑制劑依那西普、塞來昔布僅針對部分炎性細胞因子的表達進行抑制，非特異性**作用不如minocycline**有效。本研究首先觀察了給藥后海馬組織勻漿中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量，結(jié)果顯示給藥組3種炎性細胞因子的表達明顯減少，表明minocycline可以顯著抑制血管性抑郁小鼠海馬中炎性細胞因子的表達。血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

本研究采用前期研究中使用過的血管性抑郁小鼠模型，模擬缺血低灌注損傷所致的血管性抑郁，在前期工作中，本課題組在抑郁行為檢測中觀察到該模型小鼠較假手術(shù)小鼠具有明顯的抑郁行為且不伴有神經(jīng)運動功能缺損，同時在腦組織中觀察到以少突膠質(zhì)細胞減少為特征的腦白質(zhì)損傷（white matter lesions，WMLs）。而Sneed等研究證實皮層下深部白質(zhì)損傷是血管性抑郁特征性的神經(jīng)病理學(xué)改變，同時也是血管性抑郁作為老年遲發(fā)性抑郁一種亞型的依據(jù)。因此，該模型能夠有效地模擬血管性抑郁的病理生理狀態(tài)，是研究血管性抑郁的可靠模型。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連續(xù)給予minocycline抑制炎癥反應(yīng)后，實驗組小鼠抑郁行為較對照組明顯改善，進一步驗證了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子在血管性抑郁發(fā)生中的重要作用。

炎性細胞因子導(dǎo)致抑郁發(fā)生的機制很多，其中神經(jīng)遞質(zhì)消耗被認為是主要途徑之一。研究認為，炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ激活2，3-吲哚胺雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），降低了**色氨酸水平，從而導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT生成減少，是炎癥導(dǎo)致抑郁的重要分子通路。炎性細胞因子還可以通過影響5-HT轉(zhuǎn)運體的活性來調(diào)節(jié)突觸5-HT的利用度。研究證實，IL-1β、TNF-α均可通過p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）依賴的信號通路快速激活5-HT轉(zhuǎn)運體，導(dǎo)致突觸間隙5-HT減少，這也是炎癥誘發(fā)動物抑郁樣行為的機制之一。此外，炎性細胞因子激活的MAPK信號通路還可以提高多巴胺轉(zhuǎn)運體的活性，從而使多巴胺再攝取增加致使突觸間隙中多巴胺濃度降低。

血管性抑郁與應(yīng)激相關(guān)的抑郁有不同之處，患者易同時伴有以執(zhí)行功能障礙為主的認知能力損害，且對SSRI類抗抑郁藥的療效較差。本研究中，****盡管抑郁行為有所改善，但并不能顯著提高海馬勻漿5-HT和NE的含量，且DA含量明顯升高，可能由于血管性抑郁的抑郁行為并非單純基于5-HT或NE的減少，這也可能是臨床上SSRI類**療效欠佳的原因之一，因此，臨床針對血管性抑郁的患者，早期應(yīng)用具有調(diào)節(jié)多巴胺受體功能的**（如非典型性抗精神病**），可能具有預(yù)防認知障礙的作用。這與本課題前期工作通過非典型性抗精神病**預(yù)防血管性癡呆動物認知障礙及白質(zhì)髓鞘損傷的研究結(jié)果相吻合。在血管性抑郁發(fā)生過程中，炎癥對DA代謝的具體調(diào)節(jié)通路及機制有待在分子生物學(xué)實驗水平進一步完善和驗證。

本研究的不足在于，由于用藥時間較短，****對動物的認知恢復(fù)未觀察到明顯的效果，仍然不能說明****對認知改善無效。目前針對認知障礙前期——即可逆期的研究成為熱點，本研究將進一步進行長程給藥與預(yù)防性給藥對認知功能的影響，為臨床防治血管性認知障礙提供依據(jù)。血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經(jīng)遞質(zhì)的作用