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血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

【摘要】目的 探討minocycline抑制炎癥反應(yīng)對(duì)血管性抑郁小鼠行為及神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法 成年雄性CD1小鼠隨機(jī)分為3組,每組各10只,實(shí)驗(yàn)組造模后立即腹腔注minocycline每日1次連續(xù)7 d(30 mg/kg),對(duì)照組造模后給予同等劑量的生理鹽水,假手術(shù)組除不阻斷頸動(dòng)脈供血外,其余手術(shù)操作與實(shí)驗(yàn)組相同,術(shù)后同樣給予腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。術(shù)后第8天起行懸尾實(shí)驗(yàn)(第8天)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(第9天)檢測(cè)抑郁行為,水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)(第10天)檢測(cè)認(rèn)知能力。

 

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 CD1雄性小鼠30只,周齡10周,體重25~30 g(訂購(gòu)于**軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí)),隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和假手術(shù)組,每組10只,造模前常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周。

應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)中采用的反復(fù)缺血再灌注法進(jìn)行制備血管性抑郁小鼠模型。步驟如下:小鼠經(jīng)腹腔注射0.3%****麻醉成功后,取仰臥位,門(mén)齒及四肢固定,剪開(kāi)頸前皮膚及筋膜,在氣管兩側(cè)分別分離出左右頸動(dòng)脈,使用小號(hào)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈供血5 min后,松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)供血10 min,再次阻斷供血5 min后移除動(dòng)脈夾,術(shù)中密切觀察小鼠呼吸、心跳,術(shù)畢縫合皮膚,立即腹腔注射minocycline(30 mg/kg),對(duì)照組給予腹腔注射等劑量生理鹽水,恒溫板上復(fù)蘇,清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不阻斷頸動(dòng)脈供血外,其余手術(shù)操作與實(shí)驗(yàn)組相同。小鼠手術(shù)當(dāng)日定為術(shù)后第1天,術(shù)后第1~7天依照不同分組連續(xù)注射minocycline及生理鹽水每日一次,給藥完成后于術(shù)后第8天開(kāi)始行為學(xué)檢測(cè)。前期工作已發(fā)表模型組與假手術(shù)組行為學(xué)檢測(cè)的結(jié)果,在懸尾實(shí)驗(yàn)、暗箱實(shí)驗(yàn)等抑郁行為檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),模型組動(dòng)物較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的抑郁行為,確定動(dòng)物模型成功。

1.2 行為學(xué)檢測(cè) 抑郁行為學(xué)檢測(cè)包括懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test,TST)、探洞曠場(chǎng)試驗(yàn)(open-field test)、認(rèn)知功能檢測(cè)為Morris水迷宮檢測(cè)。造模術(shù)后第8天開(kāi)始行為學(xué)測(cè)試。

TST檢測(cè)動(dòng)物的抑郁行為,基于Steru等之前建立的方法稍加改進(jìn),采用上海欣軟信息科技有限公司的SuperTst小鼠懸尾系統(tǒng),安排在術(shù)后第8天1800~2200進(jìn)行,距尾尖約1 cm處用膠布固定于懸尾系統(tǒng)測(cè)試箱的尾鉤上,小鼠頭部距地面約7.5 cm,關(guān)閉測(cè)試箱開(kāi)始計(jì)時(shí),共觀察6 min,適應(yīng)2 min,設(shè)定軟件記錄后4 min的小鼠不動(dòng)時(shí)間。與假手術(shù)組的小鼠不動(dòng)時(shí)間相比較,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng),可判定為小鼠出現(xiàn)抑郁行為。

探洞曠場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的抑郁行為,根據(jù)文獻(xiàn)中介紹的通用的小鼠分析方法。采用上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動(dòng)物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)于術(shù)后第9天進(jìn)行,將小鼠依次放入曠場(chǎng)測(cè)試箱(25 cm×25 cm×38 cm)中,測(cè)試箱底部有16個(gè)圓形小洞,放入小鼠后2 min開(kāi)始記錄,測(cè)試時(shí)間15 min,記錄探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間與總路程。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M小鼠較假手術(shù)組小鼠探洞次數(shù)減少、活動(dòng)時(shí)間縮短或總路程減少且差異有顯著性時(shí),可判定為該組小鼠出現(xiàn)抑郁行為。血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

Morris水迷宮檢測(cè)動(dòng)物的認(rèn)知行為,按照文獻(xiàn)中對(duì)小鼠空間認(rèn)知檢測(cè)的方法進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動(dòng)物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)水迷宮裝置,水池直徑120 cm,高50 cm,維持水溫21~22,第三象限放置平臺(tái),平臺(tái)置于水面下1 cm,術(shù)后第10天開(kāi)始測(cè)試(第9天進(jìn)行訓(xùn)練,每只小鼠訓(xùn)練4次,每次120 s),隨機(jī)選擇4個(gè)象限作為入水點(diǎn),將動(dòng)物面向池壁放入水中,同時(shí)開(kāi)始記錄小鼠入池至尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間,即潛伏期(latency),使其在平臺(tái)上停留20 s后取走,如小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)則將其引導(dǎo)上臺(tái)并停留20 s,記錄潛伏期為120 s,計(jì)算每只小鼠的平均潛伏期。

2 結(jié)果

2.1 minocycline對(duì)血管性抑郁小鼠抑郁行為及認(rèn)知能力的影響 懸尾實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組的小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間差異具有顯著性(F=6.59,P=0.005)(表2),SNK檢驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組懸尾不動(dòng)時(shí)間縮短,差異有顯著性,實(shí)驗(yàn)組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于假手術(shù)組,但兩組差異無(wú)顯著性;探洞曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組的小鼠探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程差異具有顯著性(F=6.17,P=0.008;F=11.55,P<0.001;F=13.47,P<0.001),SNK檢驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程均增多,且差異有顯著性,實(shí)驗(yàn)組較假手術(shù)組的探洞次數(shù)增多、活動(dòng)時(shí)間減少,但兩組間差異無(wú)顯著性,實(shí)驗(yàn)組較假手術(shù)組小鼠活動(dòng)路程減少,且差異有顯著性。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,3組小鼠的潛伏期差異有顯著性(F=16.09,P<0.001),SNK檢驗(yàn)顯示,與假手術(shù)組相比,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組潛伏期延長(zhǎng),但兩組間相比潛伏期差異無(wú)顯著性。結(jié)果表明,經(jīng)給予minocycline**處理后,血管性抑郁小鼠的抑郁行為可得到改善,但其認(rèn)知能力卻無(wú)明顯改善。

2.2 minocycline對(duì)小鼠海馬組織腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6含量的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組小鼠海馬組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量差異均有顯著性(F=13.42,P<0.001;F=18.69,P<0.001;F=5.49,P=0.010),SNK檢驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組3種促炎性細(xì)胞因子均降低,差異有顯著性,實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬炎癥因子含量稍高于假手術(shù)組,但兩組差異無(wú)顯著性。結(jié)果顯示,minocycline對(duì)血管性抑郁小鼠海馬組織中3種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均有抑制作用。

血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

2.3 minocycline對(duì)小鼠海馬組織5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量的影響 通過(guò)對(duì)前處理方法的優(yōu)化,*終選擇2%的HClO4生理鹽水溶解,以保證3種神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性,在此色譜條件下,3種神經(jīng)遞質(zhì)的色譜峰完全分離,保留時(shí)間分別為1.35 min,2.65 min,4.56 min,典型的色譜圖如圖2所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示,從結(jié)果看出3種化合物在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r>0.9990。海馬組織勻漿中3種神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示,3組樣本中5-HT、DA的含量差異具有顯著性(F=4.17,P=0.026;F=5.18,P=0.012),NE的含量差異無(wú)顯著性(F=2.13,P=0.139)(圖3)。SNK檢驗(yàn)顯示,與實(shí)驗(yàn)組相比,對(duì)照組和假手術(shù)組5-HT含量差異無(wú)顯著性,但假手術(shù)組5-HT含量高于對(duì)照組;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組DA含量增高,差異具有顯著性,但兩組間DA的含量差異無(wú)顯著性。結(jié)果表明,minocycline對(duì)血管性抑郁模型小鼠海馬中5-HT和NE無(wú)明顯影響,但DA含量增加血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

3 討論

1997年Alexopoulos**提出血管性抑郁的概念,但腦血管**導(dǎo)致抑郁發(fā)生的機(jī)

制不明。Alexopoulos分析了一系列臨床研究后于2011年提出了血管性抑郁發(fā)病機(jī)制的炎癥反應(yīng)假說(shuō),認(rèn)為年齡及腦血管病相關(guān)的炎癥過(guò)程介導(dǎo)了抑郁癥狀的發(fā)生。

薈萃分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)典的SSRI類抗抑郁**可降低血清中TNF、IL-1β、IL-6水平,TNF-α拮抗劑依那西普和非甾體**藥塞來(lái)昔布對(duì)重癥抑郁患者的癥狀改善具有一定的**效果,但機(jī)制仍不明確。盡管****抑郁的研究取得一定進(jìn)展,但針對(duì)血管性抑郁的**干預(yù)研究仍然較少。

**代半合成四環(huán)素類**minocycline可快速通過(guò)血腦屏障,抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng),其**作用主要通過(guò)直接和間接地抑制**神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖,進(jìn)而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的釋放表達(dá)。而前述的炎癥反應(yīng)抑制劑依那西普、塞來(lái)昔布僅針對(duì)部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行抑制,非特異性**作用不如minocycline**有效。本研究首先觀察了給藥后海馬組織勻漿中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量,結(jié)果顯示給藥組3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)明顯減少,表明minocycline可以顯著抑制血管性抑郁小鼠海馬中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

本研究采用前期研究中使用過(guò)的血管性抑郁小鼠模型,模擬缺血低灌注損傷所致的血管性抑郁,在前期工作中,本課題組在抑郁行為檢測(cè)中觀察到該模型小鼠較假手術(shù)小鼠具有明顯的抑郁行為且不伴有神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能缺損,同時(shí)在腦組織中觀察到以少突膠質(zhì)細(xì)胞減少為特征的腦白質(zhì)損傷(white matter lesions,WMLs)。而Sneed等研究證實(shí)皮層下深部白質(zhì)損傷是血管性抑郁特征性的神經(jīng)病理學(xué)改變,同時(shí)也是血管性抑郁作為老年遲發(fā)性抑郁一種亞型的依據(jù)。因此,該模型能夠有效地模擬血管性抑郁的病理生理狀態(tài),是研究血管性抑郁的可靠模型。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連續(xù)給予minocycline抑制炎癥反應(yīng)后,實(shí)驗(yàn)組小鼠抑郁行為較對(duì)照組明顯改善,進(jìn)一步驗(yàn)證了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子在血管性抑郁發(fā)生中的重要作用。

本研究的不足在于,由于用藥時(shí)間較短,****對(duì)動(dòng)物的認(rèn)知恢復(fù)未觀察到明顯的效果,仍然不能說(shuō)明****對(duì)認(rèn)知改善無(wú)效。目前針對(duì)認(rèn)知障礙前期——即可逆期的研究成為熱點(diǎn),本研究將進(jìn)一步進(jìn)行長(zhǎng)程給藥與預(yù)防性給藥對(duì)認(rèn)知功能的影響,為臨床防治血管性認(rèn)知障礙提供依據(jù)血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用。

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