［摘要］ 目的研究甲狀腺素、硫辛酸及兩藥聯(lián)合**對(duì)甲狀腺功能減退大鼠認(rèn)知功能損傷的改善，以及血清、海馬組織中超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、丙二醛( malondialdehyde，MDA) 的變化。方法 成年 SD 雄性大鼠50 只，每組10 只，隨機(jī)分為5 組，對(duì)照組、甲減組［丙硫氧嘧啶( PTU) 組］、左甲狀腺素鈉( L-T4) 組( PTU + L-T4 組) 、硫辛酸( LA) 組( PTU + LA 組) 、聯(lián)合用藥組( PTU + L-T4 + LA 組) 。8 周后以 Morris 水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清和海馬組織 SOD 活力，采用硫代***酸法測(cè)定血清和海馬組織MDA 含量。結(jié)果 與對(duì)照組比較，PTU 組定位航向?qū)嶒?yàn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ; 空間探索能力成績(jī)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; SOD 活性降低( P ＜ 0． 001) ，MDA 含量升高( P ＜ 0． 001) 。與 PTU 組比較，PTU + L-T4 組、PTU + LA 組、PTU + L-T4 + LA 組大鼠逃避潛伏期均縮短，SOD 活力升高，MDA 含量降低( P ＜0． 05) 。結(jié)論 LA 和 L-T4 聯(lián)合**改善氧化應(yīng)激，顯著改善甲狀腺功能減退大鼠的認(rèn)知功能。

［關(guān)鍵詞］甲狀腺功能減退癥; 海馬; 認(rèn)知功能; 甲狀腺**

甲狀腺功能減退癥( 甲減) ，指血清甲狀腺**水平低于正常范圍，是一種常見(jiàn)的*****。甲狀腺**不僅在**神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟和功能維持中起重要作用，而且參與**認(rèn)知功能。研究發(fā)現(xiàn)，甲減可引起認(rèn)知功能減低、學(xué)習(xí)記憶能力下降，更被認(rèn)為是癡呆的一種危險(xiǎn)因素。本研究通過(guò)抗氧化劑和甲狀腺**聯(lián)合**觀察甲減模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的改善，通過(guò)氧化應(yīng)激及抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)超氧化物歧化酶( superox-ide dismutase，SOD ) 和 丙 二 醛( malondialdehyde，MDA) 的變化，闡述抗氧化劑對(duì)甲狀腺功能減退大鼠抗氧化應(yīng)激能力的改善。

1 材料與方法

1． 1 動(dòng)物模型

采用成年清潔級(jí) Sprague-Dawley 雄性大鼠 60只( 190 ± 15) g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心( 生產(chǎn)許可證號(hào) 2011-002) 。飼養(yǎng)環(huán)境: 標(biāo)準(zhǔn)鼠籠分籠飼養(yǎng)，每籠 5 只，自由攝食飲水，自然光照，溫度( 23 ±2) ℃，相對(duì)濕度( 45%～ 50%) 。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d 后隨機(jī)預(yù)留 10 只作對(duì)照組，正常飲水，其余 50 只納入實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)甲減模型，飲用水中加入含有 0． 05% ( W/V) 丙硫氧嘧啶( propylthiouracil，PTU) ，每周稱取大鼠體質(zhì)量。4 周后，模型組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、飲食飲水量較前減少，體質(zhì)量增加緩慢，隨機(jī)選取 10 只，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)甲狀腺功能。

1． 2 **干預(yù)

甲減模型建成后，除對(duì)照組外，將 40 只甲減大鼠隨機(jī)分為 4 組進(jìn)行干預(yù)**。包括: 甲減組( PTU組) 、硫辛酸( lipoic acid，LA) 組( PTU + LA 組) 、左甲狀腺素鈉( levothyroxine sodium，L-T4) 組( PTU +L-T4 組) 、聯(lián)合用藥組( PTU + L-T4 + LA 組) 。每天8∶ 00 PTU + L-T4 + LA 組、PTU + L-T4 組按 0． 02 μg /g L-T4 灌胃，其余各組按等量生理鹽水灌胃; 18∶ 00PTU + LA 組和 L-T4 + LA 組按 120 mg / kg LA 灌胃，其余各組按等量生理鹽水灌胃。連續(xù) 4 周，期間除對(duì)照組飲用**無(wú)菌水外其余各組繼續(xù)飲用0． 05%( W/V) PTU 水。

1． 3 主要試劑和儀器

PTU 由上海朝暉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)( 產(chǎn)品批號(hào)1205F13) 。LA 由江蘇萬(wàn)禾制藥有限公司提供 ( 產(chǎn)品批號(hào) 110401) 。L-T4 由德國(guó) Merck 公司生產(chǎn)( 產(chǎn)品批號(hào) 145574) 。SOD、MDA 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Morris 水迷宮系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司提供) 。MultiskanMK3 型酶標(biāo)儀( 荷蘭雷勃公司產(chǎn)品) 。

1． 4 行為學(xué)檢測(cè)

**干預(yù) 3 周后所有大鼠行 Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試，檢測(cè)大鼠認(rèn)知及記憶能力。實(shí)驗(yàn)期間，室內(nèi)光照盡量保持一致，迷宮周圍物品及空間線索保持固定不變。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括: ①適應(yīng)性訓(xùn)練: 實(shí)驗(yàn)前3 d每天讓動(dòng)物在無(wú)**平臺(tái)的水中適應(yīng)性游泳;②定位航行實(shí)驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)歷時(shí) 5 d，每天下午將大鼠面向池壁，分別從 4 個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間 ( 逃避潛伏期 ) ，如果在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，潛伏期記為 120 s，由操作者幫助大鼠找到平臺(tái)，并在平臺(tái)中央停留 10 s，實(shí)驗(yàn)后將大鼠放回籠中; ③空間探索實(shí)驗(yàn): 第 6 天撤去平臺(tái)，將大鼠由任一入水點(diǎn)下水，記錄 120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)所在象限的時(shí)間、平均速度和總路程及穿越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。

1． 5 標(biāo)本采集與制備

各組大鼠按每 100 g 體質(zhì)量 10% 水合氯醛0． 3 ml 麻醉，仰臥固定在手術(shù)板上，常規(guī)**，腹部正中切口，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，普通離心機(jī) 3500 r/min離心后取上層血清分為兩份，一份于 4℃ 冰箱保存待測(cè)三碘甲腺原氨酸( triiodothyronine，T3) 、甲狀腺素( thyroxine，T4) 、促甲狀腺素( thyrotropin，TSH) ，另一份于 －20℃冰箱保存待測(cè) SOD、MDA。大鼠取血后斷頭處死，迅速在冰盤(pán)上剝?nèi)ワB骨后，以打孔方式( 15 gauge) 取出海馬組織，以 4℃預(yù)冷的生理鹽水洗去余血，置于液氮中冷凍，保存于 － 80℃ 低溫冰箱。檢測(cè)海馬組織相關(guān)指標(biāo)時(shí)，取出海馬組織，準(zhǔn)確稱量后按 1∶ 9( W/V) 比例在 0． 9% 生理鹽水中勻漿制成 10%海馬組織勻漿懸液，用于海馬組織 SOD、MDA 的測(cè)定。

1． 6 甲狀腺**和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)方法

采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定 T3、T4、TSH 水平。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定 SOD 活性，采用硫代***酸法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物 MDA 含量。所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1． 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17． 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以x珋 ± s 表示，大鼠 Morris 水迷宮行為學(xué)數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，**次入水成績(jī)及平均成績(jī)比較采用單因素方差分析，其他相關(guān)測(cè)試指標(biāo)均采用單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。

2 結(jié)果

2． 1 各組大鼠甲狀腺**水平比較

與對(duì)照組比較，PTU 組、PTU + LA 組 T3、T4 水平明顯下降，TSH 水平明顯升高( P ＜0． 01) ; PTU +L-T4 組、PTU + LT-4 + LA 組，雖然 T3、T4 均有所降低，TSH 有所升高，但比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與PTU 組比較，PTU + L-T4 組、PTU + L-T4 + LA 組 T3、T4 升高 TSH 降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 組與 PTU組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 表 1) 。

2． 2 各組大鼠 Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試成績(jī)比較

2． 2． 1 用單因素方差分析比較大鼠定位航向?qū)嶒?yàn)成績(jī)

2． 2． 1． 1 每日大鼠平均逃避潛伏期比較 與 PTU組比較，PTU + LA 組、PTU + L-T4 + LA 組、PTU +L-T4 組每天平均逃避潛伏期均縮短( P ＜ 0． 05 ) ; 與對(duì)照組比較，PTU + LA 及 PTU + L-T4 組逃避潛伏期雖比 PTU 組短，但前 2 d 逃避潛伏期比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0． 05) ; PTU + L-T4 + LA 組逃避潛伏期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( 圖 1) 。

2． 2． 1． 2 每日大鼠**次入水逃避潛伏期比較與 PTU 組比較，PTU + LA組、PTU + L-T4 + LA 組、PTU + L-T4 組每天**次入水逃避潛伏期均縮短，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ; 與對(duì)照組比較，PTU 組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0．05) ; 而 PTU 組、PTU + L-T4 組、PTU + LA +L-T4 組逃避潛伏期略長(zhǎng)，但比較均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與每日平均潛伏期比較結(jié)果基本一致。見(jiàn)圖2。

2． 2． 2 用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析比較各組大鼠定位航向?qū)嶒?yàn)差異 重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析是目前對(duì) Morris 水迷宮數(shù)據(jù)分析使用較多的方法，用一般線性模型( general linear model，GLM) 的重復(fù)測(cè)量過(guò)程實(shí)現(xiàn)重復(fù)測(cè)量資料的單變量方差分析，并用多因素方差分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上組間的兩兩比較，判斷大鼠空間學(xué)習(xí)能力。本研究中，通過(guò)球形檢驗(yàn)的結(jié)果為 P ＞ 0． 01( P = 0． 115) ，不拒絕球形假設(shè)，需校正 F 界值( 利用球?qū)ΨQ系數(shù)對(duì)自由度進(jìn)行校正) 。分析表明，個(gè)體內(nèi)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F =29． 637，P ＜0． 001) ，逃避潛伏期隨時(shí)間變化縮短。但時(shí)間和分組的交互作用比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F =1． 103，P =0． 357) ，表明時(shí)間因素不隨分組的不同而改變。組間變異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F =100． 637，P ＜ 0． 001) ，表明分組對(duì)大鼠逃避潛伏期有作用，5 組間大鼠每次入水逃避潛伏期比較均不同。與 PTU 組比較，**組大鼠逃避潛伏期均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ，與對(duì)照組比較，PTU 組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0． 05) ，**組大鼠雖然逃避潛伏期縮短，但比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Morris水迷宮對(duì)甲狀腺功能減退大鼠認(rèn)知功能的影響 。

2． 2． 3 各組大鼠空間探索能力比較 各組大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)空間探索實(shí)踐的強(qiáng)度( 120 s 內(nèi)穿越原目標(biāo)所在象限的時(shí)間、總路程、平均速度及穿越目標(biāo)位置的次數(shù)、**次穿越目標(biāo)所用時(shí)間) 。與 PTU組比較，PTU + LA 組、PTU + LT-4 + LA 組、PTU +L-T4 組各項(xiàng)指標(biāo)均升高，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P ＜0． 01) ( 表 2) 。

2． 3 各組大鼠血清及海馬組織 MDA 含量和 SOD活性比較

與對(duì)照組比較，PTU 組 MDA 含量明顯升高( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 組與對(duì)照組比較，MDA 含量降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 組、PTU + LA + L-T4組分別與對(duì)照組比較，MDA 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 3A、B) 。與對(duì)照組比較，PTU 組 SOD 活性明顯下降( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 組與對(duì)照組比較，SOD活性降低，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) ;PTU + LA 組、PTU + LA + L-T4 組分別與對(duì)照組比較，SOD 活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 3C、D)

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，甲狀腺**( T4) 在人體神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。研究表明，甲狀腺功能減退引起**神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，致海馬區(qū)學(xué)習(xí)、記憶、注意力、執(zhí)行功能的受損，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。T4 替代**后，在 T4 及 TSH 水平恢復(fù)正常時(shí)，仍有部分患者持續(xù)存在認(rèn)知功能受損。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在 PTU 誘導(dǎo)的甲減大鼠模型中，甲減可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，L-T4 替代**能部分逆轉(zhuǎn)甲減大鼠的認(rèn)知功能。本研究通過(guò)對(duì)甲減大鼠進(jìn)行抗氧化劑 LA 聯(lián)合 L-T4 替代**，觀察大鼠認(rèn)知功能的恢復(fù)及與氧化應(yīng)激相關(guān)酶的變化。

LA 作為自然界*強(qiáng)的天然抗氧化劑，被稱為“萬(wàn)能抗氧化劑”，可增加多種組織( 包括大腦組織) 中的谷胱甘肽和其他內(nèi)源性抗氧化劑水平，對(duì)腦組織神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、神經(jīng)元再生及與腦細(xì)胞代謝有一定作用。LA 組單藥**與 PTU 組相比，對(duì)大鼠甲狀腺**無(wú)明顯作用，但是 LA 聯(lián)合 L-T4 替代**后，大鼠甲狀腺功能可基本恢復(fù)正常，同時(shí)對(duì)大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論 LA 單藥**抑或聯(lián)合 L-T4 都可使大鼠記憶能力改善。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧( ＲOS) 引起的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致多種記憶損傷的關(guān)鍵因素，常用 SOD 活性及其代謝產(chǎn)物MDA 的含量等指標(biāo)判斷氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究在對(duì)與記憶有密切關(guān)系的海馬組織氧化應(yīng)激相關(guān)酶學(xué)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LA 可使海馬 SOD 水平升高，MDA下降，通過(guò)**脂質(zhì)氧化及氧自由基，促進(jìn)神經(jīng)元再生，**替代聯(lián)合抗氧化劑可使甲減大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高至正常大鼠基本相當(dāng)水平，這與 de Chaves等的觀點(diǎn)相符。Morris水迷宮對(duì)甲狀腺功能減退大鼠認(rèn)知功能的影響。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是研究空間學(xué)習(xí)記憶的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，過(guò)程包括: 適應(yīng)性訓(xùn)練、定位航向?qū)嶒?yàn)、空間探索能力。對(duì)于 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，國(guó)內(nèi)外的研究較多，通過(guò)對(duì)大鼠逃避潛伏期的比較探討各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，檢測(cè)較靈敏，數(shù)據(jù)誤差較小。研究表明，在水迷宮定位航向?qū)嶒?yàn)中，大鼠入水象限不同、入水次序不同對(duì)大鼠記憶都有影響，因此，選擇合適的實(shí)驗(yàn)方法及統(tǒng)計(jì)方法，對(duì) Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠記憶能力及空間認(rèn)知功能起重要作用。有學(xué)者認(rèn)為，每天第 1 次定位航行訓(xùn)練的成績(jī)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以反映出大鼠前 1 d 的記憶力。對(duì)大鼠5 d 的訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，PTU 組大鼠訓(xùn)練成績(jī)明顯較其余 4組差，PTU + LA 組與 PTU + L-T4 組大鼠**次入水逃避潛伏期有所波動(dòng)，而 PTU + LT-4 + LA 組大鼠逃避潛伏期持續(xù)縮短，這種差異考慮可能與大鼠對(duì)周圍環(huán)境抗應(yīng)激能力前 1 d 記憶能力有關(guān)，說(shuō)明聯(lián)合用藥有助于大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)。另有學(xué)者認(rèn)為，把每天 4 次訓(xùn)練平均成績(jī)作為評(píng)價(jià)記憶能力的指標(biāo)，各組大鼠每天逃避潛伏期均較前 1 d 縮短，PTU 組逃避潛伏期明顯較當(dāng)天其余組大鼠長(zhǎng)，PTU +LA 組及 PTU + L-T4 + LA 組大鼠逃避潛伏期與對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明抗氧化輔助**對(duì)大鼠長(zhǎng)時(shí)記憶能力改善較顯著。另有近年較為新興的重復(fù)設(shè)計(jì)方差分析，動(dòng)態(tài)觀察不同組別大鼠在每天不同時(shí)間點(diǎn)不同象限的水迷宮逃避潛伏期比較，過(guò)程雖復(fù)雜，但通過(guò)組內(nèi)及組間比較能較直觀地反映逃避潛伏期與時(shí)間及時(shí)間 × 組別的關(guān)系。本研究中所有組別大鼠逃避潛伏期均縮短，各**組分別與對(duì)照組及甲減組比較，個(gè)體時(shí)間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各**組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均較 PTU 組強(qiáng)，L-T4 及 LA 單獨(dú)用藥雖能改善記憶能力，但聯(lián)合用藥后有累加作用。說(shuō)明 LA 可促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)元修復(fù)，改善記憶功能。因此，本研究為目前臨床**甲退患者輔助使用抗氧化劑提高生活質(zhì)量提供堅(jiān)實(shí)依據(jù)。