摘 要 目的:用脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 建立阿爾茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 炎癥模型大鼠，觀察淫羊藿苷( Icariin ICA) 對該模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及超微結(jié)構(gòu)的影響。方法: 經(jīng)八臂迷宮訓(xùn)練成功的 45 只雄性 Wistar 大鼠隨機分為對照組、模型組、淫羊藿苷 30mg/kg 組、淫羊藿苷 120mg/kg 組、雙氯芬酸組10mg/kg 組，采用側(cè)腦室注射 LPS( 10μl) 制作實驗性 AD 炎癥模型，并八臂迷宮測驗并記錄其數(shù)據(jù)。迷宮測驗完成后斷頭取腦海馬組織。應(yīng)用電鏡觀察大鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，用 SPSS 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果: ⑴側(cè)腦室注射 LPS( 10μl) 后對大鼠一般情況觀察出現(xiàn)了行為異常。⑵八臂迷宮測試系統(tǒng)分析結(jié)果: 制模后與對照組相比，其它各組大鼠總記憶錯誤( TE) 、參考記憶錯誤( ＲME) 、工作記憶錯誤( WME) 明顯增多，用淫羊藿苷**后與模型組比較，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組 10mg/kg 組大鼠的 TE、ＲME、WME 均明顯減少，淫羊藿苷 30mg/kg組錯誤選擇次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。超微結(jié)構(gòu)觀察示: 對照組、海馬組織線粒體比較規(guī)則，淫羊藿苷 120mg/kg 組、雙氯芬酸組線粒體輕度受損，模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞核固縮，核周隙擴(kuò)張，甚至核膜結(jié)構(gòu)不清，核形態(tài)極不規(guī)則。結(jié)論: 側(cè)腦室注射LPS( 10μl) 能成功復(fù)制AD 炎癥動物模型; 淫羊藿苷 120mg / kg 組顯著改善 AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，淫羊藿苷對炎癥模型大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 淫羊藿苷; 阿爾茨海默病炎癥模型; 電子顯微鏡; 超微結(jié)構(gòu)

阿爾茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一種常見的**神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知功能的下降，行為異常和社交障礙。其發(fā)病機制有很多學(xué)說，其中炎癥機制受到廣泛關(guān)注。眾多研究表明****是**阿爾茨海默病的一種潛在**方案并研究提示**可改善 AD 病理改變。應(yīng)用脂多糖可誘導(dǎo)阿爾茨海默病炎癥模型大鼠模型。淫羊藿甙具有**，抗氧化等多種生物學(xué)活性?；谝陨侠碚?，聯(lián)系阿爾茨海默病的炎癥機制和淫羊藿的**作用本實驗?zāi)康氖墙⒅嗵钦T導(dǎo)的 AD 炎癥模型大鼠，通過八臂迷宮測驗淫羊藿苷對該模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，用電鏡觀察海馬組織 CA1 區(qū)的超微結(jié)構(gòu)并探討及其作用機制。

1 材料與方法

1． 1 試驗** 淫羊藿苷 ( ICA) 西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號: XC071223，純度 ＞98% ( HPLC) 。

1． 2 動物 普通成年雄性 Wistar 大鼠 45 只，體重 220 ～ 280g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，均為清潔級動物，動物合格證號為: SCXK( 蒙) 2002-0001 ，分組分籠飼養(yǎng)，充分光照，每 12 小時明暗交替，( 光照時間: 8∶ 00 ～20∶ 00) 控制室溫 18-21℃ ，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食，使其體重控制在自由進(jìn)食體重的 80%～ 85% 。適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 天。

1． 3 試劑 脂多糖 ( LPS) 美國 SIGMA 公司，批號: 127K4048貨號: L2880。

1． 4 儀器 八臂迷宮分析測試系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ，腦立體定位儀( 上海欣軟信息科技有限公司) ，H-600 型透視電鏡( 日本株式會社產(chǎn)品)

1． 5 方法 八臂迷宮動物空間記憶測試是研究認(rèn)知功能機制的*常用方法之一，本研究也采用放射狀八臂迷宮( 四臂放食物) 訓(xùn)練 Wistar 大鼠，以建立一種有效評價淫羊藿對大鼠空間記憶影響。在進(jìn)行放射狀八臂迷宮實驗前限制大鼠禁食，不限制飲水，維持其體重原體重的 80% ～ 85%。行為學(xué)觀察均在10∶ 00 ～ 17∶ 00 進(jìn)行。訓(xùn)練前大鼠先在迷宮中適應(yīng) 2 d，每天2 次。適應(yīng)時 3 ～ 4 只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物 10 min。適應(yīng)后進(jìn)行每天 2 次的訓(xùn)練。每次訓(xùn)練中，八臂中只有四臂放置了食物( 分別為 1、3、4 和 6 號臂) ，整個實驗過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央?yún)^(qū)，此時中央?yún)^(qū)四周用門關(guān)住 15 s 將門打開，大鼠可選擇進(jìn)入任意一臂攝取食物，測試定時3 分鐘。大鼠進(jìn)入有食物的臂且攝取了食物為 1 次正確選淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用擇，否則為錯誤選擇。記錄參數(shù)為錯誤選擇的次數(shù)。重新進(jìn)入放食物臂稱工作記憶錯誤( working memory error，WME) ，進(jìn)入不放食物臂稱為參考記憶錯誤( reference memory error，ＲME) 。兩者之和為總記憶錯誤( total error，TE) 。連續(xù) 5 次訓(xùn)練總錯誤選擇次數(shù)為1 次或1 次以下，認(rèn)為訓(xùn)練成功。ＲM-200 八臂迷宮分析測試系統(tǒng)采用紅外探測的方式跟蹤大鼠的行為，采用微電腦控制，可自動得出測定結(jié)果。八臂迷宮訓(xùn)練成功的 Wistar 大鼠 45 只隨機分為 5 組，分別為對照組、模型組、淫羊藿苷 30mg/kg 組、淫羊藿苷 120mg / kg 組、雙氯芬酸鈉 10mg / kg 組，每組淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

Wistar 大鼠 9 只。大鼠八臂迷宮訓(xùn)練成功后次日通過側(cè)腦室注射 LPS 溶液誘導(dǎo) AD 炎癥模型，具體方法如下: 3% ****鈉40 ～ 50mg / kg 腹腔注射，麻醉大鼠，將鼠頭固定于腦立體定位儀上保持前后囪在同一水平，剪開頭頂部毛發(fā)，碘酊**后切開皮膚，按照 George Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》進(jìn)行定位，選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū)在前囪點后方 1． 0 mm，中線旁開 1．6mm，用柔性顱骨鉆鉆一小孔，用微量注射器緩慢自腦表面垂直進(jìn)針深度為 3． 4mm( 達(dá)側(cè)腦室) ，將 5ug/ul LPS 溶液 10μl 緩慢注入，留針 2min 后緩慢撤針，縫合切口。對照組注入等體積無菌性生理鹽水。造模后**天始用藥結(jié)束止分別通過八臂迷宮實驗觀察大鼠的空間記憶能力，以判定模型的成敗和**的療效。八臂迷宮測試系統(tǒng)記錄分析大鼠的 ＲME 、WME、TE 每只大鼠測試兩次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1． 5． 1 給**法

對照組: 大鼠側(cè)腦室注射生理鹽水后次日起，蒸餾水連續(xù)灌胃 14 天，方法為用灌胃針將蒸餾水按 1ml/100g( 大鼠體重) 灌入大鼠胃內(nèi)，1 次 / d; AD 模型組: 大鼠 AD 模型制備后次日起，蒸餾水連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次/d; 淫羊藿苷 30mg/kg 組: 大鼠 AD 模型制備后次日起淫羊藿苷30mg / kg，連續(xù)灌胃 14 天，方法為用灌胃針將淫羊藿苷混懸液( 配制 ICA 濃度為 0． 3%) 1ml/100g 灌入大鼠胃內(nèi)，1 次/d; 淫羊藿苷 120mg/kg 組: 大鼠 AD 模型制備后次日起，淫羊藿苷120mg / kg 連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 雙氯芬酸組: 大鼠AD 模型制備后次日起，雙氯芬酸鈉( 配制雙氯芬酸鈉濃度為 0．1% ) 10mg / kg 連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 雙氯芬酸鈉給藥劑量參照人的給藥劑量，按體重、體形系數(shù)算出。八臂迷宮測試完成后 24h 內(nèi)用 2% ****鈉腹腔麻醉( 40 ～50mg/kg) 快速取腦后分離海馬組織，液氮保存。

1． 5． 2 電鏡標(biāo)本的制作及大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的觀察 每組隨機選取 3 只大鼠，10% 水合氯醛麻醉后，快速取腦，并將取出的腦組織置于冰上，分離海馬，3% 戊二醛中 4℃ 冷藏，經(jīng)過清洗、后固定、脫水、浸透、包埋聚合，光鏡下定位 ，選取海馬 CA1 區(qū)富含神經(jīng)元部位制成超薄切片( 70nm) ; 經(jīng)醋酸鈾電子染色劑染色后置于透射電鏡下觀察并拍照。淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

1． 6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 13． 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。描述性資料以( x ± s) 表示，計量資料經(jīng)齊性檢驗方差齊采用單因素方差分析，組間比較用 LSD 法，檢驗水準(zhǔn) a =0． 05。

2 結(jié)果

2． 1 一般情況觀察 模型組與其它組比較，大鼠活動減少，體毛少澤，神情呆滯，反應(yīng)欠靈，食欲減退。

2． 2 八臂迷宮實驗結(jié)果

制模前每只大鼠的總記憶錯誤≤1，分組并制模后與對照組比較其它各組大鼠記憶能力明顯減低，總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤顯著增多，表明側(cè)腦室注射脂多糖后大鼠的記憶能力明顯受損，阿爾茨海默病模型制作成功。**后與模型組比較，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤顯著減少，淫羊藿苷 30mg/kg 組總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤無統(tǒng)計學(xué)意義，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組比較總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤無統(tǒng)計學(xué)意義。

2． 3 電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體規(guī)則，核呈圓形或橢圓形，核膜雙層結(jié)構(gòu)清晰，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，可見核孔、單個或兩個核仁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含各種細(xì)胞器及包涵物、排列有序。線粒體大小及形態(tài)正常，內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，神經(jīng)氈內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)正常。見圖 1，2。淫羊藿苷 30mg/kg 組神經(jīng)細(xì)胞損傷較重，線粒體嵴斷裂，呈空泡化改變，胞質(zhì)內(nèi)可見脂褐素顆粒沉積，但核膜清楚，見圖 3，4 。模型組可見大鼠海馬 CAI 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，稀疏少見，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，變形，胞膜皺縮，胞體縮小，胞漿濃縮，細(xì)胞器稀疏，線粒體數(shù)目明顯減少，線粒體靖排列紊亂，甚至斷裂消失，神經(jīng)細(xì)胞核固縮，核膜結(jié)構(gòu)不清，核形態(tài)不規(guī)則，有切跡，核偏位，線粒體腫脹，可見嵴斷裂，空泡形成。見圖 5，6。淫羊藿苷 120mg/kg 組大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞損傷較輕，為神經(jīng)元胞體較大，核圓，核膜清晰，核仁明顯; 胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較豐富; 排列有序，神經(jīng)氈內(nèi)突起結(jié)構(gòu)正常，突觸數(shù)量較多。見圖 7，8。雙氯芬酸組大鼠海馬內(nèi)結(jié)構(gòu)基本正常，突觸前膜內(nèi)突觸小泡較清晰 ，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較多，排列較整齊。

3 討論

3． 1 阿爾茨海默病的驗證機制及淫羊藿苷的**作用 據(jù)報道炎癥與阿爾茨海默病的發(fā)病有關(guān)。在阿爾茨海默病患者腦中，Aβ 肽可引起炎癥反應(yīng)而致神經(jīng)元喪失和認(rèn)知功能障礙。研究證實 Aβ 可激活膠質(zhì)細(xì)胞而引起炎癥反應(yīng)。體外研究發(fā)現(xiàn)，激活的膠質(zhì)細(xì)胞可通過炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素 1( IL-1) 、化學(xué)因子及神經(jīng)**物質(zhì)而引起神經(jīng)毒作用。IL-1 也可進(jìn)一步引起其他神經(jīng)因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素 6( IL-6)。在

膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)，有與炎癥有關(guān)的酶，如 P38 分裂素激活蛋白激酶( p38mitogen-activated protein kinase，p38 MAＲK) 和環(huán)氧化酶 2( cyclooxygenase-2，COX-2) 可被激活而導(dǎo)致神經(jīng)元損害。尸檢已證實，在 AD 患者腦中存在參與炎癥過程的補體蛋白、細(xì)胞因子及蛋白酶。還有研究發(fā)現(xiàn)腦部淀粉樣蛋白周圍的炎癥減輕使神經(jīng)元存活率明顯上升。

迄今為止，AD 尚無特效**方法和**。目前** AD 的主要**包括乙酰膽堿酯酶抑制劑、腦細(xì)胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進(jìn)劑、神經(jīng)營養(yǎng)藥、雌**以及抗氧化劑等。****源于 AD 的炎癥假說。*近研究顯示 tao 蛋白及神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD 發(fā)病中占有重要地位，并把神經(jīng)炎癥機制作為防治 AD 的重要靶點。

流行病學(xué)資料表明長期用 NSAIDs 能降低 AD 發(fā)生的危險性，由于長期服用甾體類**藥副作用較大且對患者的記憶力有損害，這就限制了廣泛用于預(yù)防 AD 的應(yīng)用。所以既有**作用，副作用又小的**是當(dāng)前研究的焦點。本實驗應(yīng)用NSAIDs 雙氯芬酸鈉作為對照組發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷 120mg / kg 組與雙氯芬酸鈉作用相當(dāng)，并淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥副作用小，對其作用的機制可能也是**作用，本實驗根據(jù)炎癥機制給大鼠側(cè)腦室注射 LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生 AD 炎癥模型。并用八臂迷宮測試系統(tǒng)測試后結(jié)果與對照組比較模型組 WME，ＲME，TE 顯著增高;表明比較成功的復(fù)制了 AD 炎癥模型。淫羊藿是一種**有效的天然****，其部分機制是可能的多重聯(lián)系的親炎癥細(xì)胞因子的干預(yù)( 腫瘤壞死因子-α 和 IL -6) ，炎癥介質(zhì)( NO) 和粘附分子( 表面 CD11b) 。近期國外對淫羊藿苷的研究表明淫羊藿苷可保護(hù) LPS 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)降解。

3． 2 淫羊藿苷對海馬超微結(jié)構(gòu)的影響 1931 年德國科學(xué)家研制出了世界上**臺透射電子顯微鏡，為人類認(rèn)識細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，對于研究**的病理生理變化有著非常重要的意義。為了更深入的了解 AD 的病理變化，我們選用透射電鏡觀察該模型海馬 CAI 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。通過觀察發(fā)現(xiàn)，對照組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。( 見圖 1，2) 羊藿苷 30mg/kg 組和模型組，大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出不同程度的損傷，尤其以線粒體的腫脹、空泡化、可見嵴斷裂，空泡形成，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒為突出表現(xiàn)，而這種損傷改變以 模型組更為嚴(yán)重淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組與對照組相比較，線粒體的結(jié)構(gòu)也有輕度的損傷。但細(xì)胞器豐富，排列規(guī)則。推測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的下降很可能是由于神經(jīng)細(xì)胞受到損傷間接造成的。而淫羊藿苷 120mg/kg 組可有效保護(hù)及修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

本實驗用脂多糖成功復(fù)制出阿爾茨海默病炎癥模型大鼠，淫羊藿苷**后用電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)顯示淫羊藿苷對炎癥模型大鼠有很好的保護(hù)作用，其機制是否是**有關(guān)目前尚未證實，這將是我們下一步工作的重點。