摘 要:目的:利用焦慮動物模型研究桑葉抗焦慮作用及其物質(zhì)基礎。方法:將小鼠隨機分為空白對照組(蒸餾水 0.375 mL)、地泮對照組(0.0023 g/kg)、桑葉組(4.5 g/kg)、真空處理桑葉組(4.5 g/kg),每組 10只,雌雄各半,灌胃給藥,1 次/d,連續(xù)灌胃 4 d 后,依次采用自主活動儀、明暗箱、高架十字迷宮考察**對小鼠的行為影響;高效液相色譜法(HPLC)檢測行為學實驗后小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)含量。結(jié)果:與空白對照組比較,真空處理桑葉組可顯著增加小鼠在明箱停留時間(P<0.05),并顯著提高小鼠開臂滯留時間百分比(OT%)(P<0.05)。小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測顯示,真空處理桑葉組、桑葉組均可顯著降低小鼠腦組織 5-羥色胺(5-HT)濃度(P<0.05),去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)濃度也有降低,但無統(tǒng)計學差異。結(jié)論:桑葉具有抗焦慮作用,且其物質(zhì)基礎可能為 γ-氨基丁酸(GABA)。
關鍵詞:桑葉;抗焦慮;γ-氨基丁酸;明暗箱;高架十字迷宮
桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測試
焦慮癥是一種具有持久性焦慮、恐懼、緊張情緒和植物神經(jīng)活動障礙的腦機能失調(diào),常伴有運動性不安和軀體不適感。臨床**焦慮癥的**主要有苯二氮卓類、非苯二氮卓類、抗抑郁藥以及腎上腺受體阻滯劑等,盡管這些**見效快、療效好,但易產(chǎn)生耐受性,長期應用可產(chǎn)生依賴性及突然停藥產(chǎn)生戒斷反應等。因此,尋找一種**有效的抗焦慮**迫在眉睫。
桑葉是一種藥食兩用產(chǎn)品,治病入藥始于東漢,具有疏散風熱、清肺**、平肝明目、涼血止血的功效?,F(xiàn)代藥理研究證明桑葉具有降血糖、***、**、抗病毒等作用,但對桑葉抗焦慮作用的研究報道極少。筆者等運用自主活動儀、明暗箱和高架十字迷宮多種焦慮動物模型觀察桑葉的抗焦慮作用,并初步探究其抗焦慮作用的物質(zhì)基礎。
1 材料與方法
1.1 動物
SPF 級昆明種小鼠,初始質(zhì)量 18-22 g,雌雄各半,購自重慶市第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。
1.2 **與試劑
桑葉,采自重慶北碚西南大學桑之源基地,經(jīng)西南大學李學剛教授鑒定;地泮片劑(華中藥業(yè)股份有限公司,批號:20120601);去甲腎上腺素(美國 Sigma 公司,批號:1001423402);多巴胺(美國 Sigma 公司,批號:101171997);5-羥色胺(美國 Sigma 公司,批號:1001344074);無水乙醇(AR);磺基水楊酸;高氯酸(AR);乙酸鈉(色譜純);乙酸(AR);甲醇(色譜純);乙二胺四乙二鈉鹽。
1.3 儀器
LC-6AD 高效液相色譜儀(日本島津公司);Auanti J-30I 高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司);臺式低速大容量離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司);SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空泵(上海亞榮生化儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);JA2003B 電子天平(上海精天電子儀器有限公司);F6/10-6G 超細勻漿器 (弗魯克流體機械制造有限公司)。
備注:XR-XZ301 自主活動儀(上海欣軟信息科技有限公司);自制明暗箱;XR-XG201 十字迷宮跟蹤分析系統(tǒng) (上海欣軟信息科技有限公司);
1.4 方法
1.4.1 真空處理的桑葉水提醇沉浸膏的制備 取新鮮桑葉 500 g,置于真空裝置中,于 20 ℃靜置 8 h。用蒸餾水回流提取 3 次,合并,減壓濃縮到 150-200 mL,添加 3 倍體積的 95%乙醇,放置冷卻 12 h 以上,過濾,上清液減壓濃縮至 200 mL 左右,備用。
1.4.2 動物分組及給藥 取 40 只 SPF 級昆明種小鼠,雌雄各半,隨機分為空白對照組(蒸餾水 0.375 mL)、陽性**地泮對照組(0.002 3 g/kg)、桑葉組(4.5 g/kg)、真空處理桑葉組(4.5 g/kg)共 4 組,每組 10 只。桑葉、真空處理桑葉制成水提醇沉浸膏后給藥,連續(xù)灌胃給藥 6 d,1 次/d。
1.5 行為學實驗
1.5.1 桑葉對小鼠自主活動行為的影響 在第 4 天灌胃后分別于 0 h、1 h、2 h、3 h 將小鼠放入自主活動儀中測定 5 min 內(nèi)小鼠的活動次數(shù)和站立次數(shù)。
1.5.2 桑葉對小鼠明暗箱行為的影響 在第 5 天灌胃 30 min后,將小鼠置于明暗箱的明箱中央,頭朝暗箱,記錄 5 min內(nèi)小鼠的穿箱次數(shù)、小鼠在明箱的滯留時間及跨格次數(shù)。
1.5.3 桑葉對小鼠高架十字迷宮行為的影響 在第 6 天灌胃后的 30 min,將小鼠置于迷宮中央,頭朝閉臂。分別記錄 5 min 內(nèi)小鼠進入開放臂和封閉臂的次數(shù)、停留時間
及在兩臂滯留的總時間。計算小鼠進入開臂的次數(shù)占總?cè)氡鄞螖?shù)(進入開臂和閉臂的次數(shù)之和)的百分率(OE%)及在開臂滯留時間占總?cè)氡蹠r間(在開臂和閉臂滯留時間之和)的百分率(OT%)。
1.6 小鼠腦組織內(nèi) NE、DA、5-HT 含量測定
1.6.1 樣品預處理 行為學實驗后,立即斷頭處死小鼠,迅速取出腦組織,稱重后放入加 500 μL 0.4 mol/LHClO4的 Ependet 離心管中,冰浴勻漿。渦旋后置冷凍離心
機 (4 ℃),10 000 r/min 離 心 10 min, 將 上 清 液 轉(zhuǎn) 入Eppen-dorf 離心管中,再次離心,取上清液,用 HPLC 法測定腦組織中 NE、DA、5-HT 含量。
1.6.2 色譜條件 色譜柱為 Hypersil ODS2高效液相色譜柱 (4.6 mm × 200 mm,5 μm)。流動為 0.1 mol/L 的CH3COONa 緩 沖液 - 甲醇(9 ∶1),流速 1.0mL/min,進樣量每次 20 μL。發(fā)射波長 330 nm,激發(fā)波長 290 nm。柱溫:25 ℃。1.7 統(tǒng)計學處理用 SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,采用單因素方差分析 (One-way ANONA) 進行檢驗,多組間比較采用Duncan’s Test 檢驗,數(shù)據(jù)以 X±S 表示。
2 結(jié)果
2.1 桑葉對小鼠自主活動的影響
與空白對照組比較,**組在灌胃后 2 h,小鼠在自主活動儀中的活動次數(shù)和站立次數(shù)均減少,且真空處理桑葉組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05)。
2.2 桑葉對小鼠明暗箱行為的影響
與空白對照組比較,**組均能增加小鼠跨格次數(shù)、在明箱的滯留時間。兩個桑葉組小鼠在明箱內(nèi)的跨格次數(shù)與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。同時,真空處理桑葉組小鼠在明箱滯留時間與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。
2.3 桑葉對小鼠高架十字迷宮行為的影響
與空白對照組相比,**組均能增加小鼠開臂進入次數(shù)百分比(OE%)、開臂滯留時間百分比(OT%)。地泮組及真空處理桑葉組 OE%、OT%與空白對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)。
2.4 桑葉對小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響與空白對照組相比,**組小鼠腦組織中 NE、DA、5-HT 含量均降低。兩個桑葉組小鼠腦組織中 5-HT 含量與空白對照組比較有顯著性差異 (P<0.05)。3 討論
桑葉中 GABA 的平均含量可達 2.26 mg/g,真空處理后的桑葉中 GABA 的含量將會增加。GABA 是**神經(jīng)系統(tǒng)中含量*多、*重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),通過與下一個神經(jīng)元膜上的受體結(jié)合,開放氯離子通道,使氯離子內(nèi)流,使細胞膜超極化,抑制動作電位的發(fā)生,從而阻止焦慮相關的信息抵達腦指示**。本研究結(jié)果顯示,桑葉和真空處理后的桑葉對小鼠的**神經(jīng)系統(tǒng)均有抑制作用,且后者作用強于前者,說明桑葉中 GABA 含量越高,其抑制作用越明顯。
明暗箱、高架十字迷宮都是評價**抗焦慮作用的經(jīng)典實驗模型。桑葉水提醇沉浸膏和真空處理后的桑葉水提醇沉浸膏都表現(xiàn)出對小鼠的抗焦慮作用,且真空處理后的桑葉組較空白對照組有顯著性差(P<0.05),說明桑葉中的 GABA 含量越高,其抗焦慮作用越明顯。5-HT 是與心境障礙相關的關鍵性神經(jīng)遞質(zhì),目前研究認為 5-HT 的多個受體皆與焦慮障礙有密切關系。其中,5-HT3受體屬于配體門控離子通道偶聯(lián)受體,激活 5-HT3受體可以開放陽離子通道而觸發(fā)細胞快速去極化,導致胞漿內(nèi)鈣離子濃度迅速升高,繼而誘發(fā)神經(jīng)元釋放遞質(zhì)。而抑制性神經(jīng)遞質(zhì) GABA 使細胞膜超極化,不容易去極化,導致 5-HT3受體不能激活,從而抑制 5-HT 釋放。此外,5-HT1B、5-HT2C與 GABA 也有相互調(diào)節(jié)作用。同時,焦慮癥的產(chǎn)生還與 NE、DA 的釋放有關,已有動物實驗發(fā)現(xiàn),焦慮模型小鼠腦組織內(nèi)的NE、DA、5-HT 都有升高,而使用抗焦慮**的小鼠腦內(nèi)這 3 種神經(jīng)遞質(zhì)水平會降低。本研究用 HPLC 色譜法分析行為學實驗后的小鼠大腦中 NE、DA、5-HT 含量,**組 3 種神經(jīng)遞質(zhì)含量較空白組均降低,證明了桑葉的抗焦慮作用。桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測試
綜上所述,桑葉抗焦慮作用可能是桑葉中的 GABA 作用于**神經(jīng)系統(tǒng),與 NE、DA、5-HT 協(xié)同作用阻礙焦慮信息的傳達,從而產(chǎn)生抗焦慮作用,具體機理有待進一步研究。