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黃連**湯對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶自發(fā)活動(dòng)的影響

摘要 目的:探討黃連**湯對(duì)衰老小鼠的抗衰老作用及其機(jī)制。方法:采用皮下注射D-半乳糖的方法制備衰老小鼠模型。將ICR小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、1、2、4和8g/kg黃連**湯生藥量處理組,采用自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的自主活動(dòng),用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,用硫代***酸法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定腦組 織 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)和 丙 二 醛(MDA)含量。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退,MDA含量增加,SOD活性降低。黃連**湯各劑量組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善,與1g/kg和8g/kg相比,2g/kg和4g/kg黃連**湯組小鼠腦內(nèi)的MDA含量明顯降低,SOD活性顯著增高。結(jié)論:黃連**湯能顯著改善D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能與其抗氧化特性有關(guān)。黃連**湯對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶自發(fā)活動(dòng)的影響。
關(guān)鍵詞  黃連**湯;D-半乳糖;衰老;抗氧化
衰老是由多種復(fù)雜因素相互作用引起的生物學(xué)過程,是生命周期中按一定規(guī)律發(fā)生在機(jī)體、器官、組織細(xì)胞的形態(tài)和功能的演變過程。在動(dòng)物衰老模型中,由中國學(xué)者提出的利用大劑量D-半乳糖造成動(dòng)物的糖代謝障礙,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)代謝和脂類代謝,致使動(dòng)物組織、細(xì)胞出現(xiàn)一系列退行性變化,較為符合人類自然衰老時(shí)所出現(xiàn)的癥狀。
黃連**湯(huanglian-jian-du-tang,HJDT)出自《外臺(tái)秘要》,由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味生藥組成,為清熱**的經(jīng)典方劑。近年來,國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界對(duì)HJDT的現(xiàn)代藥理學(xué)研究中,應(yīng)用了大量的實(shí)驗(yàn)方法和動(dòng)物模型對(duì)其進(jìn)行了多方面的研究。結(jié)果表明,HJDT具有保護(hù)肝損傷及改善腦缺血等作用,在對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默?。ǎ粒模┬∈蟮难芯恐校l(fā)現(xiàn)HJDT可能通過提高抗氧化能力,對(duì)AD小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。但是,HJDT對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過D-半乳糖致衰老模型,觀察HJDT對(duì)亞急性衰老小鼠的行為學(xué)以及腦組織中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影響,進(jìn)一步為黃連**湯預(yù)防衰老作用提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑  D-半乳糖購自amresco公司(批號(hào):2032C149)。黃連**湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶3∶2∶3比例混合,藥材購自浙江省華東醫(yī)藥股份有限公司并經(jīng)鑒定,加水浸泡1h,水煎2次,煎液濃縮至生藥含量為2g/mL,pH 7.0。考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、SOD(批號(hào):20121228)、MDA(批號(hào):20121231)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。
    1.2 動(dòng)物與分組
ICR小鼠90只,雌雄各半,體重23~27g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證:SCXK(滬)2007-0005]。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南,動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22±2)℃下,12h明暗循環(huán),自由飲食和飲水。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、衰老模型組、HJDT?。?、2、4和8g/kg組,每組15只。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后,采取頸背部皮下注射的方法,衰老模型組及各給藥組給予D-半乳糖溶液150mg/kg,正常對(duì)照組給予等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)12周。其中后6周,HJDT各組增加灌胃給予HJDT?。?、2、4和8g/kg。正常對(duì)照組和衰老模型組增加灌胃給予同等量生理鹽水,每日1次。
 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,先將小鼠放到自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1h。將小鼠頭朝前輕輕放入活動(dòng)箱中央,關(guān)上箱門,拍攝記錄自發(fā)活動(dòng)1h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用小鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng),提取活動(dòng)軌跡及小鼠在開場(chǎng)各區(qū)域的活動(dòng)路程、停留次數(shù)、停留時(shí)間等指標(biāo)。
1.4 跳臺(tái)試驗(yàn)
      小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)反射箱由不透明有機(jī)玻璃分隔為5間,箱底為銅柵,通以36V電流,每間設(shè)置一高為3.0cm、直徑為3.2cm橡皮墊作為動(dòng)物回避電擊的**區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí),將小鼠置于箱中,自由活動(dòng)5min,然后將其置于**臺(tái)上,箱底通電,觀察其跳臺(tái)的潛伏期(latency,L)并記錄5min內(nèi)小鼠跳下臺(tái)的次數(shù),即錯(cuò)誤次數(shù)(mistake,M),此為訓(xùn)練成績,24h后再測(cè)為測(cè)試成績。
1.5?。樱希暮停停模恋壬笜?biāo)含量測(cè)定
 小鼠腦組織用濾紙拭干后,精密稱重并盡快剪碎與冷生理鹽水按體積比1∶9混合,用勻漿器打勻后離心10min,分離出上清液即得10%的組織勻漿,按照試劑盒說明書方法測(cè)定MDA含量(硫代***酸法)。將10%組織勻漿稀釋10倍后按照試劑盒說明書方法分別測(cè)定SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)和蛋白含量(考馬斯亮藍(lán)顯色法)。黃連**湯對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶自發(fā)活動(dòng)的影響
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組均數(shù)間比較采用One-ANOVA檢驗(yàn),兩兩比較采用Newman-Keuls法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1?。龋剩模詫?duì)衰老小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響  與正常對(duì)照組相比,衰老模型組在總路程、中央路程和中央時(shí)間有減小的趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1,P>0.05)。HJDT各劑量組與衰老模型組相比也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1,P>0.05)
    2.2 HJDT對(duì)衰老小鼠腦組織SOD、MDA含量的影響  與正常對(duì)照組相比,模型組腦組織SOD含量明顯降低,而MDA含量顯著升高(圖1~2,P<0.01)。與衰老模型組相比,HJDT?。?、4g/kg組腦組織SOD含量顯著提高(圖1,P<0.05)、HJDT 2、4、8g/kg組MDA含量顯著降低(圖2,P<0.05)。
2.3?。龋剩模詫?duì)衰老小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響  與正常對(duì)照組相比,模型組在跳臺(tái)試驗(yàn)的測(cè)試中,潛伏期明顯縮短,錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(圖3~4,P<0.01)。而HJDT 1、2、4g/kg能明顯延長潛伏期(圖3,P<0.05),1、2、4、8g/kg減少錯(cuò)誤次數(shù)(圖4,P<0.01)。
3 討論
衰老是生命進(jìn)程中不可避免的生理功能的退化過程,這個(gè)過程包括認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)功能障礙等方面,在較短時(shí)間內(nèi)連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D-半乳糖,在半乳糖氧化酶的作用下可以轉(zhuǎn)變成醛糖和氫過氧化物,從而導(dǎo)致過氧化物陰離子和氧自由基的大量生成和堆積,影響正常滲透壓,引起細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂,導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)損傷,學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降,引起衰老。而腦衰老的特征表現(xiàn)為認(rèn)知功能和活動(dòng)能力等方面的行為缺陷,這與氧化損傷和炎癥密切相關(guān),氧化性損傷成為衰老和其他與衰老相關(guān)的如AD、帕金森?。ǎ校模┑?*的關(guān)鍵。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,可以通過歧化作用**超氧陰離子自由基,從而保護(hù)機(jī)體的細(xì)胞和組織,延緩衰老過程。但隨著年齡的增長,機(jī)體**自由 基 的 能 力 下 降,產(chǎn) 生 大 量 代 謝 產(chǎn) 物 如MDA,MDA?xí)ㄟ^降低膜的流動(dòng)性以及改變膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能引起細(xì)胞膜的損傷,進(jìn)而加速機(jī)體衰老。因此SOD含量的高低可以間接反映機(jī)體**自由基的能力,而MDA含量的高低可以間接反映細(xì)胞的衰老程度。
近年來在**神經(jīng)性損傷方面的大量研究表明,HJDT在腦缺血、腦缺氧模型中可降低大鼠腦、肝、胰組織的MDA含量,抑制過氧化脂質(zhì)的生成及消除氧自由基作用。能促進(jìn)腦缺血?jiǎng)游飳W(xué)習(xí)記憶行為,其作用機(jī)制可能與減少腦中自由基終產(chǎn)物MDA含量、增加大腦皮質(zhì)和海馬組織腦血流量有關(guān)。在AD大鼠模型中,黃連**湯可以調(diào)整其**功能和增加**能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HJDT可以增加由D-半乳糖引起的衰老小鼠的SOD活性,減少MDA的產(chǎn)生。在行為學(xué)方面,模型組和HJDT各組對(duì)自發(fā)活動(dòng)中總路程、中央?yún)^(qū)的活動(dòng)路程以及中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間無顯著影響,但在跳臺(tái)試驗(yàn)中,HJDT能夠延長跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的潛伏期,減少錯(cuò)誤次數(shù),相對(duì)于模型組,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。提示其作用機(jī)制可能與其增強(qiáng)對(duì)氧自由基的**作用,減少體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生,改善D-半乳糖引起的氧化應(yīng)激損傷,防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載從而起到抗氧化,抗衰老的作用有關(guān),其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研 究。從 藥 物 的 劑 量 上 看,以2g/kg和4g/kg劑 量 的HJDT的 效 果 較 為 明 顯,而8g/kg的劑量在SOD含量及跳臺(tái)試驗(yàn)中均作用不大。
綜上所述,中等劑量的HJDT能通過提高腦組織SOD活性和降低MDA含量,能有效地改善D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。
 

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