Morris水迷宮在血管性癡呆大鼠海馬中的影響
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF 級(jí)Wistar 大鼠80 只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重200 ～ 250 g，雌雄比例為1∶ 1，所有實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于廣州**廣州總醫(yī)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)房?jī)?nèi)溫度( 22 ± 3) ℃，濕度60%，5 只/籠，光/暗周期為12 h /12 h，實(shí)驗(yàn)期間自由獲取水及標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。
1. 1. 2 主要試劑兔抗鼠5-HT6司，Envision 二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Dako 公司，二氨基聯(lián)苯胺( DAB) 試劑購(gòu)自福州邁新生物公司，其余化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。
1. 1. 3 主要儀器Morris 大鼠水迷宮，SuperMaze 動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技) ，日本Olympus BX-51 顯微鏡， ImagePro plus 病理圖文分析系統(tǒng)。
1. 2 方法
1. 2. 1 動(dòng)物分組及模型制作所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后隨機(jī)分成兩組，VD 組50 只，假手術(shù)組( SO 組) 30 只。動(dòng)物術(shù)前禁食、禁水4 h，稱重后以10%水合氯醛按350 mg /kg 體重腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定后常規(guī)**頸部手術(shù)區(qū)域，在頸前正中作一長(zhǎng)約1 cm 的縱形切口，鈍性分離皮下軟組織、頸前肌群，在氣管的側(cè)后方找到頸動(dòng)脈鞘，分離頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，以1 號(hào)絲線長(zhǎng)久性結(jié)扎頸總動(dòng)脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈，局部**后恢復(fù)組織層次并縫合皮膚。SO 組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余操作與VD 組大鼠一致。術(shù)后動(dòng)物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。
1. 2. 2 動(dòng)物行為學(xué)觀察( Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)) 大鼠Morris 水迷宮為一內(nèi)徑160 cm、高50 cm 的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆成黑色，池壁上黏貼不同形狀的空間標(biāo)記物，一個(gè)直徑為12 cm的逃生平臺(tái)固定于水池中的某一象限( 即目標(biāo)象限) ，進(jìn)水后水面高出平臺(tái)約1 cm，水池上方橫架安裝連接計(jì)算機(jī)顯示系統(tǒng)的攝像儀。
SO 組和VD 組大鼠分別在雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷術(shù)后4、8 w進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，第1 ～ 4 天( 即trial 1、trial 2、trial 3、trial4) 將大鼠從四個(gè)不同象限面向水池壁放入水中，大鼠找到逃平臺(tái)后終止信息采集，*長(zhǎng)采集時(shí)間為120 s，若超過(guò)120 s大鼠仍未能找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至逃生平臺(tái)并在平臺(tái)上站立20 s 以使其形成對(duì)空間參照物的記憶，每只大鼠如此訓(xùn)練4次/d，每次訓(xùn)練之間有15 s 間歇以便休息，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄大鼠找到平臺(tái)的逃避潛伏期評(píng)估其空間學(xué)習(xí)能力; 第5 天將逃生平臺(tái)從水池中撤去，將大鼠從四個(gè)不同象限投入水中，記錄60 s 內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限搜尋的時(shí)間，以此評(píng)估大鼠的空間記憶能力。每天固定在8: 00 ～ 17: 00 進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持房間內(nèi)光照恒定并且無(wú)光線直射于水面，水溫控制在26℃左右，迷宮外參照物保持不變。1. 2. 3 組織標(biāo)本固定、制片、染色每組各取5 ～ 6 只大鼠分別在術(shù)后的相應(yīng)觀察終點(diǎn)麻醉動(dòng)物，以4℃預(yù)冷4% 多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦后從視交叉后2 ～ 3 mm 處冠狀位切取厚度約3 mm 的腦組織，放入10% 中性甲醛溶液中固定24 h。在自動(dòng)脫水機(jī)中梯度酒精脫水、透明、浸蠟后包埋，蠟塊組織作連續(xù)冠狀切片，厚度2 ～ 3 μm。石蠟切片脫蠟、水化后分別進(jìn)行蘇木素-伊紅( HE) 染色和Nissl 染色，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡( × 400) 下觀察海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)。
1. 2. 4 **組化顯色分析海馬CA1 區(qū)5-HT6受體的分布與表達(dá)石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，置于pH6. 0 的檸檬酸鹽中高壓修復(fù); 0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，3% 過(guò)氧化氫溶液避光孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，切片滴加兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體( 1∶ 1 000
稀釋) ，置于濕盒內(nèi)4℃ 冰箱中過(guò)夜孵育; 次晨取出切片0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，滴加葡聚糖復(fù)合物( 二抗) ，室溫下孵育40 min，0. 01 mol /L PBS 沖洗5 min × 3 次，滴加DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應(yīng)，梯度酒精脫水、TO 生物透明劑透明，中性樹(shù)膠封片后鏡檢觀察。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13. 0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用x ± s 表示，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較進(jìn)行Levene 方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用單向方差分析，方差不齊采用Brown-Forsythe 法; 平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗(yàn)時(shí)采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析，不滿足Mauchly 球?qū)ΨQ檢驗(yàn)經(jīng)Huynh-Feldt 系數(shù)校正自由度。
2 結(jié)果
2. 1 大鼠Morris 水迷宮結(jié)果術(shù)后4、8 w，SO 組和VD 組大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均游泳速度均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) 。術(shù)后4 w 和8 w，VD 組大鼠與同時(shí)間點(diǎn)SO 組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長(zhǎng)( P ＜ 0. 001) ，提示VD 組大鼠在術(shù)后無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙，但存在空間學(xué)習(xí)能力減退，而且學(xué)習(xí)能力下降隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)加重。術(shù)后4 w 空間探索試驗(yàn)中，SO 組和VD 組大鼠目標(biāo)象限的平均搜尋時(shí)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＜ 0. 001) ，提示VD 組大鼠空間記憶能力下降。
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