【摘要】 目的觀察β-淀粉樣蛋白1-40（Aβ1-40）大鼠海馬雙側(cè)注射后大腦組織Caspase-3表達和海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化及加減地黃飲子的干預(yù)作用。方法采用大鼠海馬立體定向注射凝聚態(tài)Aβ1-40誘導(dǎo)阿爾茨海默?。ˋD）動物模型。采用**印跡方法檢測大腦組織Caspase-3的表達，通過透射電子顯微鏡觀察海馬組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果模型組大鼠大腦組織Caspase-3蛋白表達相對值（2.647±0.603 6）較假手術(shù)組（0.901±0.102）明顯升高（P＜0.05），而加減地黃飲子(1.331±0.105 3)可下調(diào)Caspase-3的表達（P＜0.05）。Aβ1-40可致模型組大鼠海馬神經(jīng)元的胞體質(zhì)膜下出現(xiàn)大量的脂褐素，游離核蛋白體減少，加減地黃飲子對損傷有不同程度的恢復(fù)。結(jié)論加減地黃飲子通過上調(diào)Caspase-3蛋白的表達而發(fā)揮保護Aβ對大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默??；加減地黃飲子；Caspase-3

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of modified decoction of Rehmanniae on expression of caspase-3 protein and ultrastructural changes of pyramidal neurons in hippocampal in Alzheimer′s disease (AD) rats induced by amyloid-β1-40 injection into brain.Methods AD model rats were induced by amyloid-β1-40 sterotaxis injection.Modified decoction of Rehmanniae was given by oral administration for 28 days.Expression of caspase-3 protein in rat brain was estimated by Western blotting method.Ultrastructure of pyramidal neurons in hippocampal was observed by transmission electron microscope.Results The expression of caspase-3 in model group (2.647±0.603 6) was significantly higher than that in sham group(0.901±0.102) （P＜0.05）,and that in the modified decoction of Rehmanniae group (1.331±0.105 3) was significantly lower than that in model group （P＜0.05）.Lipofuscin deposit in hippocampal neurons in model group and the cell apparatus numbers decreased.Modified decoction of Rehmanniae treatment had protective effects on the neuronal cells damnification.Conclusions Modified decoction of Rehmanniae protect brain neurons from being injuried by Aβ1-40 by up-regulating the expression of caspase-3 protein.

　　【Key words】 Alzheimer′s disease；Modified decoction of Rehmanniae；Caspase-3
　　阿爾茨海默?。ˋD）是一種以進行性認(rèn)知障礙和記憶能力損傷為主的**神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性**，目前認(rèn)為AD患者記憶力減退和認(rèn)知功能障礙的主要相關(guān)病理現(xiàn)象是神經(jīng)元丟失〔1〕，有研究提示，神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡是神經(jīng)元丟失的主要原因，體外研究發(fā)現(xiàn)AD的核心成分β-淀粉樣蛋白(Aβ)能誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡〔2〕。Caspase家族激活是大多數(shù)細(xì)胞凋亡的共同途徑，并且其抑制劑可阻斷Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，提示Caspase在AD神經(jīng)元退變中起重要作用〔3〕。為此，我們采用海馬立體定向注射技術(shù)將Aβ1-40注入大鼠雙側(cè)海馬誘導(dǎo)AD模型，并觀察加減地黃飲子提取物對AD模型大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達和海馬超微結(jié)構(gòu)的干預(yù)作用，揭示中藥提取物對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的保護作用及機制。
　　

　　1 材料與方法
　　1.1 實驗** 加減地黃飲子提取物：肉蓯蓉、麥冬、人參、遠志、五味子和山茱萸等用8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次2 h；生姜、薄荷和石菖蒲加10倍量水6 h提取揮發(fā)油；方中熟地、茯苓、巴戟天、石斛、大棗與醇提取后的藥渣及揮發(fā)油提取后藥渣一同加16倍的水，回流提取3次，每次1 h；醇提取濃縮液和水提取濃縮液混合，血竭等原粉加入，干燥得干膏，干膏粉碎成細(xì)粉，加入揮發(fā)油。實驗用不含賦形劑的浸膏。鹽酸多奈哌齊片由法國PFIZER PGM公司制造，產(chǎn)品批號5136903。Aβ1-40為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Aβ1-40使用前用無菌生理鹽水稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ。
　　

　　1.2 實驗動物 選用健康雄性清潔級SD大鼠100只，鼠齡8～12 w，體重(280±10) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號SCXK（京）2002-0003。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組和加減地黃飲子組共5組。
　　

　　1.3 試劑蛋白提取試劑盒Ⅰ（北京天來生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（美國Jackson Immunoresearch Laboratories公司）；Caspase-3（H-277）(德國Santa Cruz公司) ；Western blotting luminol reagent（德國Santa Cruz公司）；藍色預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kD）（Solarbio公司）；考馬斯蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余均為分析純試劑。
　　

　　1.4 儀器 JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽、JY-CZ1型單垂直電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；江灣Ⅰ型C立體定向器（**軍醫(yī)大學(xué)）；EM208S透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）；morris水迷宮分析系統(tǒng)可以由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XM101。
　　

　　1.5 方法

　　1.5.2 給**法 造模后3 d開始給藥，根據(jù)人和動物按體表面積折算的等效劑量。鹽酸多奈哌齊組按0.33 mg·kg-1·d-1，加減地黃飲子組按1.0 g·kg-1·d-1給藥，1次/d灌胃。其余3組給等體積生理鹽水，共4 w。

　　1.5.4 海馬錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察每組大鼠各取3只，Morris水迷宮測試完后立即斷頭處死，剪開頭皮，暴露顱骨，由枕骨大孔處迅速剪開顱骨，剝離腦組織，游離海馬，在含2.5%預(yù)冷的戊二醛溶液中，將海馬切成1 mm厚左右的橫斷薄片，30 min后再次在固定液中切取小于2 mm的海馬區(qū)小組織塊，繼續(xù)固定2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗后1%鋨酸后固定2 h。梯度乙醇和丙酮混合液脫水至100%丙酮，在此期間同時用溶于70%乙醇的醋酸雙氧鈾進行塊染。置于環(huán)氧樹脂包埋液滲透24 h；以環(huán)氧樹脂全包埋液包埋后，63℃聚合72 h；半薄切片定位海馬錐體細(xì)胞層后進行修快，超薄切片，枸櫞酸鉛和雙氧鈾染色后上透射電子顯微鏡觀察并拍照。
　　

　　1.6 統(tǒng)計學(xué)方法計量資料以x±s表示，運用SPSS13.0軟件，組間差異采用單因素方差分析,進一步post-hoc分析采用SNK檢驗。
　　

　　2 結(jié)果

中藥提取物對阿爾茨海默病模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)
　　2.1 加減地黃飲子對AD大鼠海馬錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響電鏡下，模型組和假手術(shù)組大鼠海馬錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常，模型組大鼠海馬神經(jīng)元的胞體質(zhì)膜下出現(xiàn)大量的脂褐素，游離核蛋白體減少。鹽酸多奈哌齊組和加減地黃飲子組胞質(zhì)內(nèi)脂褐素和尼氏體較多。突觸小泡數(shù)量明顯增多，錐體細(xì)胞的損傷有不同程度的恢復(fù)（圖1）。

　　2.2 加減地黃飲子對AD大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達的影響模型組海馬組織勻漿中Caspase-3表達相對值（2.646±0.604）較假手術(shù)組（0.901±0.102）明顯升高（P＜0.05）。加減地黃飲子組海馬勻漿中Caspase-3表達相對值（1.331±0.105）較模型組降低（P＜0.05），加減地黃飲子組海馬勻漿中Caspase-3表達相對值較鹽酸多奈哌齊組（1.804±0.280）低（P＜0.05）（圖2）。
　　

　　圖1 海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（略）
　　圖2 大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達（略）
　　

　　3 討論

　　AD主要病理特征有老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失，細(xì)胞凋亡是AD神經(jīng)細(xì)胞死亡的一條重要途徑〔5〕。Aβ對神經(jīng)元存在直接毒性作用，在體內(nèi)體外均可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，它的異常代謝被認(rèn)為是AD各種病理改變的共同通路。目前，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡已成為**AD的靶點之一。細(xì)胞凋亡是一系列蛋白酶活化后產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)，Caspases是一類調(diào)節(jié)凋亡的半胱氨酸蛋白水解酶，活化后是凋亡過程中水解特異性底物的關(guān)鍵效應(yīng)器〔6〕。雖然在細(xì)胞凋亡中存在著不同的死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Caspase-3則可能是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，它的激活是刺激特異性反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要機制〔7〕。

　　目前化學(xué)****AD收效頗微，相形之下，中藥多組分、多靶點和協(xié)同作用的特點使其更適合防治AD。地黃飲子原方出自劉完素《黃帝素問宣明論方》，用于**喑痱證。結(jié)合諸多醫(yī)家臨床應(yīng)用體會，我們提出**化痰**開竅法并將古方地黃飲子予以化裁用于AD的**，并在臨床上取得了一定療效。研究發(fā)現(xiàn)，加減地黃飲子能改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔4〕，本實驗通過立體定向海馬部位注射Aβ1-40的方法，誘導(dǎo)AD大鼠模型，以加減地黃飲子進行**干預(yù)，從凋亡相關(guān)基因Caspase-3 蛋白表達和海馬錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變方面觀察了其對Aβ誘導(dǎo)的實驗性AD模型大鼠的影響。結(jié)果顯示，模型組腦組織Caspase-3表達相對值較假手術(shù)組升高，加減地黃飲子組腦組織Caspase-3表達相對值較模型組降低（P＜0.05）；加減地黃飲子組腦組織Caspase-3表達相對值較鹽酸多奈哌齊組降低（P＜0.05）。表明Aβ1-40海馬注射促進Caspase-3蛋白表達，而加減地黃飲子對其表達則有抑制作用。通過超微結(jié)構(gòu)的觀察也發(fā)現(xiàn)加減地黃飲子對錐體細(xì)胞的損傷有不同程度的恢復(fù)作用。表明加減地黃飲子抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減少了神經(jīng)元的丟失，對AD發(fā)揮**作用。中藥提取物對阿爾茨海默病模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)