摘要：
頸髓病是由于脊柱退行變?cè)斐傻募顾璧穆圆糠质軌核?。不管怎么樣，慢性頸髓受壓的確切機(jī)制還沒有完全清楚。本研究的目的旨在建立一種有效的新的沒有錐板切除的慢性脊髓壓迫動(dòng)物模型，來復(fù)制臨床過程。系在一塊塑料板上的聚乙烯線，用來綁在一個(gè)月大的大鼠的C4椎體上，纏繞三圈。術(shù)后，隨著椎管和椎體的生長(zhǎng)，聚乙烯線逐漸長(zhǎng)入椎管背側(cè)的骨頭里，而產(chǎn)生脊髓漸進(jìn)性的壓縮。結(jié)果表明：在形成頸椎管狹窄9個(gè)月后，頸椎管狹窄模型的大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙和感覺障礙；然而，直到6個(gè)月才出現(xiàn)臨床癥狀。12個(gè)月后，70%的頸椎管狹窄模型大鼠出現(xiàn)了脊髓內(nèi)高信號(hào)。在病理切片，在形成頸椎管狹窄12個(gè)月后脊髓整個(gè)周圍壓縮。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目減少，白質(zhì)顯示華勒氏變性。本模型也許能夠復(fù)制臨床慢性頸髓壓迫的特征性臨床特點(diǎn)，包括在潛伏期和隱形神經(jīng)云減少后出現(xiàn)，進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)和感覺功能，以及代表了人類慢性頸髓壓迫。

關(guān)鍵字：動(dòng)物研究；行為評(píng)估；核磁共振；神經(jīng)元死亡；脊髓損傷。

引言：
一般認(rèn)為，慢性壓迫脊髓病的病因與頸椎的病理特點(diǎn)相關(guān)，例如椎關(guān)節(jié)硬化，韌帶骨化，椎管狹窄，以及椎間盤突出，或許由機(jī)械性壓迫和血管病變兩種因素引起所致。慢性壓迫性脊髓病隱匿性地和進(jìn)展性地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)和感覺動(dòng)能。很多病人數(shù)年沒有臨床癥狀，盡管這個(gè)時(shí)期內(nèi)存在脊髓壓迫和缺陷，一旦本**出現(xiàn)臨床癥狀，神功功能障礙進(jìn)行性加重，很少有逆轉(zhuǎn)。隨機(jī)選擇的有癥狀隊(duì)列的頸部核磁共振檢查的一項(xiàng)研究表明大于64歲的受試者26%出現(xiàn)脊髓損傷，45-64歲受試者16%出現(xiàn)脊髓損傷。臨床上，即使那些由神經(jīng)影像學(xué)確診的嚴(yán)重，檢查經(jīng)常顯示不可預(yù)料的非重要性神經(jīng)功能發(fā)現(xiàn)，和手術(shù)減壓后的可觀的神經(jīng)恢復(fù)也許是可以預(yù)料到。因此，慢性脊髓壓迫的一個(gè)急性脊髓損傷沒有的特點(diǎn)就是脊髓的可塑性。到目前為止，臨床上慢性頸髓術(shù)后效果在持續(xù)提高。不管怎樣，仍有一些不滿意的結(jié)果，即使是充分的減壓手術(shù)。這就意味著，頸髓嚴(yán)重受損以至于在病程中恢復(fù)性小。損傷過程的確切病理機(jī)制仍然不是完全清楚，但是灌注不足和血管栓塞已經(jīng)被證實(shí)是可能因素。尸體標(biāo)本的脊髓病理檢查發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少以及灰質(zhì)中的血管退行性變，以及脫髓鞘和軸索水腫。一個(gè)次病理情況的合適的模型應(yīng)該展示壓縮引入后的隱匿性神經(jīng)功能障礙的隱匿期，隨后進(jìn)行性的功能障礙時(shí)期。進(jìn)一步，做一個(gè)沒有脊髓損傷的模型具有重要意義。此研究的旨在產(chǎn)生一種新的脊髓慢性壓迫損傷模型，來滿足這些臨床條件，運(yùn)用MRI和病理學(xué)檢查來評(píng)估運(yùn)動(dòng)感覺功能。
材料：
動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)在當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)和本大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)監(jiān)督條例以及日本政府動(dòng)物保護(hù)和管理法規(guī)與日本政府飼養(yǎng)動(dòng)物通知的監(jiān)督下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用27只雄性SD大鼠，3周大，平均體重51g。在溫度22度，濕度55%實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)動(dòng)物，同時(shí)能夠自由獲取飲水和食物。
頸椎管狹窄模型的制作
術(shù)前，動(dòng)物在籠子中飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)環(huán)境。用****鈉腹腔內(nèi)注射麻醉（35mg/kg)。每只大鼠均俯臥位置于加熱板上，手術(shù)在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。體溫保持在37°C，血壓用無創(chuàng)血壓監(jiān)護(hù)儀監(jiān)護(hù)，以保持術(shù)中平穩(wěn)的生理狀態(tài)。以C4棘突為中心，做一縱行皮膚切口，從錐板上鈍性兩側(cè)椎旁肌。暴露雙側(cè)錐板，在顯微鏡下分離出C4、C5根部，并切除。然后，切除C4棘突，實(shí)行椎板去皮質(zhì)術(shù)。C4左側(cè)從側(cè)面牽拉到一側(cè)，聚乙烯通過C4椎體的腹側(cè)，固定在一塊1*2*0.5mm 大小的抵在C4椎體腹側(cè)上的塑料片上，然后纏繞三圈固定。在本模型中，隨著椎管和椎體的生長(zhǎng)，聚乙烯線逐漸長(zhǎng)入椎管的椎板里。因此形成漸進(jìn)性的脊髓壓迫。對(duì)照組只進(jìn)行C4C5椎板的暴露，不進(jìn)行捆扎。對(duì)照組10只大鼠，控制組10只大鼠，術(shù)后繼續(xù)在以上描述的實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)12個(gè)月。
神經(jīng)功能評(píng)價(jià)
BBB評(píng)分。術(shù)后1,3,6,9,12個(gè)月每組用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能。BBB評(píng)分主要用于實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)言之，BBB是21分序列，從0（沒有后肢移動(dòng)）到21分（持續(xù)協(xié)調(diào)的后肢運(yùn)動(dòng)）。0-7分為恢復(fù)的早期階段，8-13分描述恢復(fù)期的中間階段，14-21代表恢復(fù)的晚期階段，用階段性的腳趾頭的清理，主要爪子為止，步態(tài)穩(wěn)定性，指甲位置。兩名檢查者觀察和評(píng)價(jià)每只大鼠4-min的運(yùn)動(dòng)。神經(jīng)檢查運(yùn)用雙盲技術(shù)。
核磁共振研究
MRI研究：核磁共振研究在術(shù)后3、6、9、12個(gè)月，用0.4T永磁儀。檢查系列包括T1(350/25),T2O(5000/119),視野150mm，5mm厚度層面，256*256矩陣，以及4個(gè)激發(fā)點(diǎn)。掃描時(shí)間為5-6分鐘。所有的動(dòng)物在俯臥位掃描，頸段被放置在線圈的中央，位于靜態(tài)磁場(chǎng)的等中心點(diǎn)。
脊髓的橫斷面積和壓迫率，由運(yùn)用MR圖像數(shù)字轉(zhuǎn)化儀，T1加權(quán)像矢狀面通過*大壓迫水平的區(qū)域獲得。壓迫率由前后直徑脊髓的橫斷面的直徑。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的脊髓的壓迫率和橫斷面積進(jìn)行比較。
髓內(nèi)高信號(hào)區(qū)域的有無用T2加權(quán)性像來檢查。定量測(cè)量由ROI技術(shù)來測(cè)量頸段脊髓的高信號(hào)。所有序列的SDNRS被用來評(píng)價(jià)頸段脊髓來評(píng)價(jià)脊髓和其椎管內(nèi)的周圍組織。SDNRS由單獨(dú)測(cè)量脊髓的信號(hào)強(qiáng)度（平均ROI）評(píng)價(jià)和頸部外階段分碼方向，包括重影偽影。兩種獲得的變量的區(qū)別在于在同一圖像中。
組織病理學(xué)的檢查：
在MR圖像研究后，所有大鼠被處死用來做組織病理學(xué)檢查。所有的動(dòng)物用4%的甲醛主動(dòng)脈內(nèi)灌注固定。頸脊柱被取下，并固定在相同溶液中1周。標(biāo)本用0.5m乙二胺酸脫鈣，和用石標(biāo)準(zhǔn)程序蠟包埋。光學(xué)顯微鏡下標(biāo)本從C2到C7，頭段到尾端橫斷面切除，共600片，每片5μm厚。每個(gè)的第10片尼氏染色，在每個(gè)染色片段顯微拍照包含整個(gè)腹角。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，被識(shí)別出有大核仁，以及發(fā)育好的致密染色的尼氏體。核仁，正常中央，包含與周圍的細(xì)胞核正常分界。為了獲得，。為了獲得**的神經(jīng)元計(jì)數(shù)，沒有遺漏或重復(fù)，我們選擇切片5μm厚度，留下5微米的距離，基于以下立體考慮：典型的大核仁直徑大約5μm，而且這個(gè)直徑是一致；選擇切片的厚度和間隔厚度5μm球形核仁，這意味著每個(gè)切片將包含核仁的完整輪廓，他們的中央在在切片之外2.5μm之內(nèi)。因此計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的核仁，這些核仁出現(xiàn)在5μm厚度的視野中，這些核仁中央局限在5μm之內(nèi)在每個(gè)切片中央的每邊上，因此在切片間留5μm的間隔意味著立體計(jì)數(shù)能夠避免運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的遺漏或者重復(fù)。
統(tǒng)計(jì)分析：
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。BBB評(píng)分，*大跑步機(jī)速度，感覺評(píng)價(jià)，MR圖像研究的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目運(yùn)用非參數(shù)比較（Wilcoxon’s rank sum test），用spss11。p＜0.05.
結(jié)果：術(shù)后，動(dòng)物均體健，無任何感染。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12個(gè)月的生存率分別在76.9%和71.4%。它們的體重增長(zhǎng)快速，從手術(shù)時(shí)的51+-1.1克，三個(gè)月后到481.7 – 14.7 g (control rats), or to465.0 – 19.8 g (CCS model rat)。隨后，兩組體重均增加，12個(gè)月后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組體重分別增加至706.7 – 43.2 g and 679.1 – 43.9 g。兩組生長(zhǎng)無顯著差異。
神經(jīng)功能結(jié)果：
在術(shù)后3,6,9,12個(gè)月時(shí)，檢測(cè)神經(jīng)功能。在3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，沒有大鼠出現(xiàn)脊髓病癥狀，BBB評(píng)分和*大跑步機(jī)速度類似于對(duì)照組。10只實(shí)驗(yàn)組的大鼠中的2只出現(xiàn)了BBB評(píng)分和*大跑步機(jī)速度下降，術(shù)后12個(gè)月，所有實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物均出現(xiàn)了脊髓病癥狀。術(shù)后12個(gè)月實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分實(shí)驗(yàn)組（17.3 –+ 1.6)低于對(duì)照組的(20.8 +– 0.4)，實(shí)驗(yàn)組的*大跑步機(jī)速度(21.7 – +4.5m/min)，低于對(duì)照組的(33.3 –+3.5m/min)。在von frey 纖維測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)組的大鼠有著和對(duì)照組大鼠類似的過程，一直到術(shù)后6個(gè)月。3只出現(xiàn)了前肢和后肢的輕微的感覺麻木。隨后，12個(gè)月后，所有的實(shí)驗(yàn)組模型，前肢的反應(yīng)頻率下降了(26.0 –+12.6%),后肢的反應(yīng)頻率下降了(21.0 –+ 23.8%)。
核磁共振:
核磁共振檢查在頸椎模型后3/6/12個(gè)月時(shí)進(jìn)行。在MR圖像上，從6個(gè)月開始，CCS模型動(dòng)物的脊髓逐漸變平，一直惡化至12個(gè)月時(shí)。從脊髓矢狀位T1像獲得的脊髓橫截面積減少，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的減少。（表1和圖片5）。在所有的CCS模型大鼠白質(zhì)顯示髓鞘破壞，和海綿狀軸索退變。病理改變發(fā)生主要在壓縮區(qū)域下方。
組織病理結(jié)果：一種慢性頸段脊髓壓迫的大鼠模型的建立：神經(jīng)功能行為、放射學(xué)及病理結(jié)果的變化
討論：
頸髓病是壓迫性脊髓病*嚴(yán)重的后果，例如椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬，韌帶骨化，椎管狹窄，和椎間盤突出癥，但是他的病理細(xì)節(jié)沒有被理解。一個(gè)原因就是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的滿意的慢性頸脊髓受壓模型沒有建立起來。目前為止，大量的方法運(yùn)用于產(chǎn)生脊髓壓迫損傷；不管怎么樣，大多數(shù)有有用的模型僅僅適用于急性或亞急性壓迫損傷，運(yùn)用錐板切除形成脊髓損傷，因此硬脊膜組織，血管損傷和**組織形成。沒有合適動(dòng)物模型用來分析慢性頸髓壓迫的效應(yīng)。其他模型，包括腫瘤細(xì)胞的移植，螺釘?shù)臐u進(jìn)性擰緊，擴(kuò)張性薄片的移植，脊柱韌帶骨化基因大鼠。這些模型有一些缺點(diǎn)，例如腫瘤模型生長(zhǎng)過快，硬膜外組織損傷在直接薄片或者螺釘移植、基因敲出小鼠壓迫點(diǎn)缺乏選擇性，可能發(fā)生在C1-C2以外的椎體。在我們模型，聚乙烯線利用椎管本身的生長(zhǎng)，深陷在擴(kuò)大的椎管中，這將漸進(jìn)性脊髓壓迫。產(chǎn)生頸髓壓迫，而沒有在椎管上實(shí)施手術(shù)，因此硬膜外組織沒有損傷，錐板切除的**組織沒有發(fā)生。大鼠和人類的骨成熟分別是大約3-4個(gè)月大，和13-16歲大。大鼠和人類的脊髓生長(zhǎng)完成大約在出生后3個(gè)月和18歲因此，3周大小的大鼠和12個(gè)月相對(duì)應(yīng)與人類的青少年和老年。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人類的壓迫性脊髓的形態(tài)學(xué)在CT或者M(jìn)RI影像與臨床癥狀的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，如果通過CT影像學(xué)和核磁共振成像確診時(shí)脊髓橫截面積少于55-75%時(shí)，脊髓就不能耐受。另外，人類頸髓壓迫的典型特點(diǎn)是，在引起脊髓壓迫后，臨床癥狀出現(xiàn)的的隱匿性和延遲性。在本項(xiàng)研究中，頸髓壓迫沒有導(dǎo)致脊髓的急性的持續(xù)的神經(jīng)功能障礙。所有的動(dòng)物在術(shù)后都恢復(fù)了正常的神經(jīng)功能狀態(tài)。在核磁共振圖像上，頸椎管狹窄的脊髓逐漸扁平，從術(shù)后6個(gè)月開始。

結(jié)論：本研究建立了一種新的有效的，沒有直接損傷大鼠脊髓的慢性頸髓壓迫模型。在本實(shí)驗(yàn)中，用聚乙烯線捆扎C4椎體的大鼠在9個(gè)月后出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙及感覺障礙；但是，直到6個(gè)月時(shí)才出現(xiàn)臨床癥狀。這種隱匿性和延遲的癥狀正是脊髓慢性壓迫的*典型的特點(diǎn)之一。因此，本模型或許復(fù)制了人類慢性頸部脊髓壓迫的過程。